RIG-I敲除293T细胞系的建立及其对B型流感病毒复制的影响

发布时间：2023-09-17 19:14

　　CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过人工设计的单向导RNA(Single-guide RNA,sgRNA)指导Cas9蛋白对目的基因靶位点进行特异性的识别、结合和切割后,通过细胞的非同源末端连接或同源末端重组修复机制来完成对基因组的敲除与敲入的编辑技术。RIG-I是机体的一种模式识别受体,能够识别胞质中的含5′-三磷酸基团的RNA,并通过与下游信号分子MAVS相互作用,激活IRF3/7和NF-κB,从而启动I型干扰素和炎性因子的表达。已有研究表明,B型流感病毒(IBV)在感染早期能够上调RIG-I的表达水平。为了探索RIG-I是否为B型流感病毒激活抗病毒天然免疫信号通路的主要受体及其对IBV复制的影响,本研究利用CRISPR-Cas9技术对293T细胞中的RIG-I基因进行了敲除,经嘌呤霉素压力筛选到了一株稳定敲除RIG-I基因的293T(RIG-I-/-293T)细胞系。Western blotting检测发现,IBV或仙台病毒感染后该细胞系中RIG-I不再表达,说明该敲除细胞系构建成功。IBV感染RIG-I-/-293T细胞后,干扰素、炎性因子及干扰素刺激基因的转录水平与野生型...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞株和质粒
        1.1.2 实验试剂
        1.1.3 引物合成及PCR检测产物的测序
    1.2 实验方法
        1.2.1 sgRNA的设计与寡核苷酸链的合成
        1.2.2 重组Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1载体构建
        1.2.3 重组pUCA(Luc)-target载体的构建
        1.2.4 Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1的活性检测
        1.2.5 293T细胞的嘌呤霉素药物致死浓度筛选
        1.2.6 高活性Hu-RIG-I-sg RNA-p CS-1质粒的细胞转染
        1.2.7 药物筛选及单克隆培养
        1.2.8 PCR鉴定阳性克隆
        1.2.9 Western blotting鉴定阳性克隆
        1.2.1 0 RIG-I对IBV诱导的干扰素、炎性因子及干扰素刺激基因的影响
        1.2.1 1 RIG-I对IBV感染后p65、磷酸化P65、IRF3及磷酸化IRF3表达的影响
        1.2.1 2 RIG-I对IBV生长曲线的影响
2 结果与分析
    2.1 重组载体Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1的构建
    2.2 Hu-RIG-I-sgRNA-pCS-1向导及切割活性的检测
    2.3 重组载体Hu-RIG-I-sgRNA2-pCS-1可高效切割靶位点造成RIG-I基因部分缺失
    2.4 IBV及SeV感染RIG-I-/-293T细胞后RIG-I蛋白表达缺失
    2.5 RIG-I可上调IBV诱导的干扰素、炎性因子及其干扰素刺激基因的转录
    2.6 RIG-I是IBV激活抗病毒天然免疫信号通路的主要受体之一
    2.7 RIG-I抑制IBV在293T细胞中的复制
3 讨论



本文编号：3847993