虎眼万年青中新型黄酮醇合酶家族的挖掘及功能表征

发布时间：2023-11-04 09:32

　　2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族是自然界中第二大氧化酶家族。该家族中的一大类酶参与植物类黄酮的次级代谢过程。类黄酮化合物已被证实具有多种药理活性。结合已有研究,本课题重点着眼于发掘高效新颖黄酮醇合酶。以富含黄酮类化合物的植物虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Jacq)为植物材料,从中挖掘得到了一个具有铁不依赖型二氢黄酮3β羟化酶功能的黄酮醇合酶家族。1、虎眼万年青黄酮醇合酶基因的克隆及表达转录组序列挖掘获得可能编码黄酮醇合酶的13条候选基因序列;提取植物总RNA;以RNA逆转录获得的cDNA为模板,通过巢式克隆得到13条相似基因。成功构建了其中10条基因的原核表达载体,并完成了其中6个重组蛋白的可溶性表达工作。2、虎眼万年青黄酮醇合酶家族的功能表征通过构建体外酶促反应体系,以二氢黄酮醇香橙素为底物验证重组蛋白的黄酮醇合酶功能,以二氢黄酮柚皮素为底物验证其二氢黄酮3β羟化酶功能。获得两个具有体外活性的虎眼万年青黄酮醇合酶,将其分别命名为OcFLS1和OcFLS2。对于OcFLS1和OcFLS2又选择了 17个黄酮类的化合物进行了功能宽泛性的探究,证明其仅对二氢黄酮和二...

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中文摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族的研究现状
        1.1.1 2-氧化戊二酸依赖型氧化酶家族的分布
        1.1.2 2-氧化戊二酸依赖型氧化酶的结构与机理
        1.1.3 植物中2-氧化戊二酸依赖型氧化酶的分类
    1.2 黄酮醇合酶与二氢黄酮3β羟化酶
        1.2.1 具有生物活性的黄酮醇类化合物
        1.2.2 黄酮醇合酶是黄酮醇生物合成途径中的关键酶
        1.2.3 黄酮醇合酶和二氢黄酮3β羟化酶的研究进展
    1.3 富含黄酮类化合物的植物虎眼万年青
第二章 实验相关材料、试剂与仪器
    2.1 实验材料
        2.1.1 植株品种
        2.1.2 菌株与质粒
    2.2 酶、试剂盒与相关生化试剂
        2.2.1 酶与试剂盒
        2.2.2 生化试剂
    2.3 主要实验仪器
    2.4 实验常用试剂和溶液配方
        2.4.1 核酸电泳缓冲液
        2.4.2 核酸电泳琼脂糖凝胶
        2.4.3 LB培养基
        2.4.4 SDS-PAGE蛋白电泳相关溶液
        2.4.5 蛋白纯化相关溶液
第三章 虎眼万年青中黄酮醇合酶基因的克隆及生物信息学分析
    引言
    3.1 实验方法
        3.1.1 O.caudatum转录组测序
        3.1.2 植物总RNA的提取
        3.1.3 全cDNA的合成
        3.1.4 黄酮醇合酶基因OcFLSs的克隆
        3.1.5 OcFLSs生物信息学分析
    3.2 实验结果
        3.2.1 O.caudatum转录组测序结果分析
        3.2.2 植物组织RNA的提取结果
        3.2.3 OcFLSs基因克隆结果
        3.2.4 OcFLSs生物信息学分析
    3.3 本章小结
第四章 虎眼万年青中黄酮醇合酶基因的异源表达及纯化
    引言
    4.1 实验方法
        4.1.1 OcFLSs原核表达载体的构建
        4.1.2 OcFLSs的诱导表达及检测
        4.1.3 OcFLSs的纯化及浓缩
        4.1.4 OcFLSs蛋白定量
    4.2 实验结果
        4.2.1 构建含OcFLSs基因的表达载体
        4.2.2 OcFLSs的诱导表达结果
        4.2.3 OcFLSs纯化浓缩及定量结果
第五章 双功能黄酮醇合酶OcFLSs的功能表征
    引言
    5.1 实验方法
        5.1.1 黄酮醇合酶活性的测定
        5.1.2 二氢黄酮3β羟化酶活性的测定
        5.1.3 辅因子对活性的影响
        5.1.4 反应温度对活性的影响
        5.1.5 反应pH对活性的影响
        5.1.6 二价金属离子对活性的影响
        5.1.7 双功能OcFLSs相关酶促动力学参数测定
        5.1.8 OcFLSs功能宽泛性研究
        5.1.9 OcFLSs双功能体外连续催化反应能力探索
        5.1.10 OcFLSs表达模式分析
        5.1.11 OcFLSs结构生物信息学分析
    5.2 实验结果
        5.2.1 OcFLSs黄酮醇合酶功能的验证
        5.2.2 OcFLSs二氢黄酮3β羟化酶功能的验证
        5.2.3 OcFLSs是具有铁不依赖型F3H活性的新型双功能黄酮醇合酶家族
        5.2.4 反应温度对活性的影响
        5.2.5 反应pH对活性的影响
        5.2.6 二价金属离子对活性的影响
        5.2.7 双功能OcFLSs相关酶促动力学参数
        5.2.8 OcFLSs功能宽泛性研究结果
        5.2.9 OcFLSs双功能体外连续催化反应能力
        5.2.10 OcFLSs表达模式分析结果
        5.2.11 OcFLSs结构域及序列一致性分析
        5.2.12 OcFLSs系统进化关系分析
第六章 总结与展望
    6.1 研究意义与创新点
    6.2 课题进展与展望
参考文献
附录
致谢
个人简介



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