环磷酸腺苷生产酵母菌株不同阶段RNA的提取改进

发布时间：2024-03-03 10:15

　　考察了环磷酸腺苷(cyclic adenosine monphosphate,cAMP)生产酵母菌株G2在YPD培养基中不同生长阶段的总RNA提取效果,并进行了初步改进研究。选择16 h对数生长期、36 h二次生长期和60 h稳定期细胞,分别用试剂盒提取,RNA得率依次为1 010.6、171.5和91.3 ng/A600。选择高、低丰度表达基因ACT1和CYR1进行实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRTPCR),同时判断DNA污染情况;琼脂糖电泳和RNA完整值(RNA integrity number,RIN)测定判断完整性。结果显示,36 h和60 h RNA提取物都存在DNA污染,仅16 h样品能满足RNA测序要求。进一步对比了5种破壁方法在破碎细胞及相应RNA提取上的效果,添加珠打破壁步骤破碎细胞效果最好,显示对16 h细胞RNA提取效果没有明显变化,但36 h和60 h细胞的RNA得率分别提高至979.6和785.6 ng/A600,...

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【部分图文】：

图3不同时间CP值

图2RNA提取物琼脂糖凝胶电泳图4qPCR方法检查RNA提取物DNA污染情况

图1酵母菌株G2在YPD中的生长和糖耗曲线

菌株G2在20g/L葡萄糖培养基YPD中的生长和糖耗曲线如图1所示。葡萄糖在20h左右耗尽;综合糖耗和生长情况，生长3阶段对应时段分别为:对数生长期(EP)9～20h，二次生长期(DP)20～48h,48～60h间进入稳定期(SP)。2.2三阶段菌液试剂盒方法提取总....

图2RNA提取物琼脂糖凝胶电泳

RNA提取物里的DNA污染情况是判断RNA提取物质量和确定其能否被正式使用的关键环节。简单的检测方式是以RNA提取物为模板进行常规PCR反应，琼脂糖凝胶电泳观测不到目的条带时，视为RNA提取物里的DNA污染可以忽略。本实验为了便于量化比较不同阶段RNA提取物的DNA污染程度，同时....

图4qPCR方法检查RNA提取物DNA污染情况

图3不同时间CP值由图3和图4可知，ACT1基因和CYR1基因的表达中，以RNA提取物为模板的CP值一般认为≈35或≥35，说明RNA提取物中无DNA污染或其中DNA污染可以忽略;图3显示16h样品DNA污染可以忽略，而36h和60h样品则存在一定程度的DNA污染;如图4....

本文编号：3917638