一种植物原生质体分离与瞬时转化的方法

发布时间：2024-03-13 20:56

　　本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)、本氏烟草(Nicontiana benthamiana)和大豆(Glycine max)为试验材料,通过酶解法结合去除叶片下表皮的预处理,以及PEG介导的转化,建立了一种操作简单且高效的原生质体分离和瞬时转化方法,为目标基因的亚细胞定位分析和基于原生质体为受体材料进行遗传等方面的基础研究提供方法支撑。结果表明,利用上述方法, 3种植物均能获得较高产量且低破损率的原生质体,同时避免了原生质体的纯化过程。其中,拟南芥的原生质体产量最高,其次是大豆和烟草;并且,烟草和拟南芥原生质体转化效率较高,大豆较低,烟草和拟南芥原生质体的转化效率高达50%以上,分别是大豆的3.84和3.62倍。进一步的亚细胞定位分析发现,烟草和拟南芥的原生质体在GFP和RFP共转定位时存在优势,可用于目标基因的亚细胞定位分析。

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【部分图文】：

图1不同植物叶片原生质体的分离处理

瞬时转化的原生质体水平放置在20～25°C的弱光条件下培养16h后,在激光共聚焦显微镜(LSM880,CarlZeiss)下观察亚细胞定位并统计转化效率。转化效率(%)=携带荧光的原生质体数目原生质体总数×100。选取3个有代表性的视野进行统计,并计算平均值。观察绿色荧光蛋白....

图2光学显微镜观察不同植物叶片的原生质体

本研究利用PEG介导的原生质体转化法,对拟南芥、烟草和大豆原生质体进行转化比较分析。结果如图3所示,同一视野条件下,拟南芥(图3-A)和烟草(图3-B)的多个原生质体成功被转化而含有GFP信号,对比而言,大豆原生质体转化效率较低(图3-C)。进一步数据统计发现(表1),拟南芥和烟....

图3PEG介导的原生质体转化

为了分析上述方法分离的原生质体功用性,将pCAMBIA1300(GFP)和pm-rbCD3-1008(RFP)质粒分别共同转入拟南芥(图4-A)和烟草(图4-B)的原生质体,将pA7-YFP质粒转入大豆原生质体(图4-C),在激光共聚焦条件下观察亚细胞定位。结果如图4所示,拟南....

图4空载体在不同植物原生质体中的亚细胞定位

图3PEG介导的原生质体转化3讨论

本文编号：3927559