Dhori病毒核蛋白基因的重组表达及其抗体制备

发布时间：2024-03-26 01:20

　　[目的]表达和纯化Dhori病毒(DHOV)核蛋白(NP),并制备多克隆抗体。[方法]RT-PCR扩增NP基因,并克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pcDNA3.1中。将重组质粒pET-28a-NP转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NP(rNP)的表达并亲和层析纯化rNP,以抗DHOV阳性羊血清检测其抗原性,免疫新西兰兔制备抗血清,以ELISA法检测其效价。将pcDNA3.1-NP转染至Vero细胞,以间接免疫荧光法评估抗体的结合活性,Western Blotting检测抗体与重组蛋白的特异性反应能力。[结果]pET-28a-NP和pcDNA3.1-NP重组质粒构建正确,原核表达的rNP约为55.3 kDa,并能被阳性羊血清识别,制备的抗体效价为1:409 600,能特异性识别真核及原核表达产物。[结论]成功表达和纯化rNP,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究DHOV核蛋白的生物学特性及其检测试剂。

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【部分图文】：

图1NP基因的扩增和重组质粒酶切鉴定

经扩增获得了与预期条带大小相符的1380bp的特异性DNA片段，而以双蒸水为模板的阴性对照组未见条带;重组质粒pcDNA3.1-NP、pET-28aNP分别用2组内切酶酶切，凝胶电泳结果可见一条长约1380bp左右的特异性目的基因条带，与预期大小一致(图1)。测序结果表明....

图2重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE分析

用间接ELISA法对rNP免疫新西兰兔后产生的兔多抗血清进行效价测定，其血清效价为1:409600(图4)。结果表明经蛋白免疫后，在新西兰兔体内产生了高水平的抗rNP的血清。图3阳性羊血清验证重组蛋白抗原性WesternBlotting分析

图3阳性羊血清验证重组蛋白抗原性WesternBlotting分析

图2重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE分析2.5兔多克隆抗体结合活性的IFA验证

图4ELISA法检测兔多抗血清效价

用兔抗NP多克隆抗体分别对转染pcDNA3.1-NP和pcDNA3.1质粒的Vero细胞进行IFA检测，发现转染pcDNA3.1-NP重组质粒的Vero细胞内出现绿色荧光(图5A)，而空白组(转染空载质粒pcDNA3.1)的细胞未见荧光出现(图5B)。结果表明兔抗NP多克隆抗体可....

本文编号：3939149