Ratiometric-pericam-mt慢病毒的构建及其线粒体钙检测功能的验证

发布时间：2024-04-07 21:22

　　目的:基于由环状异构黄色荧光蛋白(Circularly Permuted EYFP)改造的具有线粒体定位功能的Ratiometric-pericam-mt(rp-mt)荧光蛋白构建携带有rp-mt基因的慢病毒载体,验证其在线粒体钙检测中的功能,为进一步研究线粒体钙稳态在细胞生命活动中发挥的作用提供参考依据。方法:采用慢病毒载体EF-1αF-puro和rp-mt质粒构建携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体,经脂质体法在293T细胞中与包装质粒共转染,收集构建好的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt并体外感染人肝癌细胞SNU-739,验证重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt的活性功能。结果:以慢病毒载体EF-1αF-puro为骨架质粒,成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体(EF-1αF-puro-rp-mt),收集获得的重组慢病毒滴度为4×10⁶TU/m L。将携带有rp-mt基因的慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt感染SNU-739细胞48小时后,在荧光显微镜下观察到有超过85%的细胞发出绿色荧光,定位于细胞线粒体内,且对SNU-73...

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【部分图文】：

图1慢病毒载体图谱

慢病毒载体与包装质粒共转染293T细胞48h后，收集细胞上清液，浓缩病毒。收集好的病毒进行病毒滴度测定，在荧光显微镜下观察，能看到荧光的最大稀释倍数为105和106稀释，孔内有荧光的细胞数分别为30个和5个，因此计算EF-1αF-puro-rp-mt慢病毒的滴度为4×106TU/....

图2重组慢病毒酶切体系及RT-PCR结果琼脂糖凝胶电泳

用EF-1cαF-puro-rp-mt慢病毒感染人肝癌细胞SNU-73948h后，加入经HBSS稀释后的mitotracker染色30min；用PBS洗去细胞上清液中的染料，于共聚焦显微镜绿光和蓝光下观察，如图4所示，共定位结果显示rp-mt蛋白特异性聚集于线粒体中(图4C中....

图3感染重组慢病毒293T细胞cDNA做模板PCR产物测序结果

近年来，越来越多的证据表明线粒体在细胞Ca2+稳态中发挥着重要作用。线粒体代谢的激活、细胞凋亡的诱导、胞质Ca2+的调节，都依赖于线粒体基质内游离钙离子的动态变化[17,18]。因此，从上个世纪五十年代起，就先后建立了各种检测细胞内钙离子的方法，如微电极法、核磁共振法、钙有机显色....

图4重组慢病毒感染SNU-739细胞48h荧光结果

图3感染重组慢病毒293T细胞cDNA做模板PCR产物测序结果图5Rp-mt与mitotracker共定位结果

本文编号：3947987