葡萄糖酸盐介导副溶血弧菌GntR蛋白调控宿主肠道定殖的研究

发布时间：2024-06-23 11:41

　　副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌,是一种革兰氏阴性菌,感染后主要定殖在宿主的肠道。食用生的或者未煮熟携带副溶血弧菌的海鲜产品可导致急性肠胃炎,常见的感染副溶血弧菌的临床表现有腹痛、腹泻、恶心、呕吐并伴有发热等症状。副溶血弧菌除了给人类健康带来巨大危害,还给海产品养殖业带来巨大经济损失。耐热直接溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)、Ⅲ型分泌系统(T3SS)、Ⅵ型分泌系统(T6SS)和黏附素等是副溶血弧菌常见的毒力因子,此外运动性也和副溶血弧菌的毒力相关。其中Ⅲ型分泌系统(T3SS)与副溶血弧菌的肠毒性有关,其分泌的效应蛋白在副溶血弧菌的致病性发挥重要作用。幼兔模型常被用来研究副溶血弧菌肠道致病性,通过对其减毒机制进行研究,有望为副溶血弧菌感染的防控提供新视野、新思路。前期研究通过Tn-seq在幼兔模型体内试验成功筛选出副溶血弧菌230个减毒基因,其中包括VP0058(gntR)。本研究通过同源重组的方法构建ΔgntR缺失株、质粒回补株,用幼兔模型模拟肠道感染进行验证,通过一系列的体外实验对ΔgntR缺失株的生物学特性进行评价,进一步通过RNA-seq的方法筛选GntR蛋白的下游调...

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
综述 副溶血弧菌的致病性和葡萄糖酸盐代谢途径
    1 副溶血弧菌毒力因子
        1.1 溶血素
        1.2 Ⅲ型分泌系统(T3SS)
        1.3 Ⅵ型分泌系统(T6SS)
        1.4 黏附素
    2 副溶血弧菌葡萄糖酸盐代谢途径
        2.1 葡萄糖酸盐
        2.2 病原菌和宿主的相互作用
        2.3 葡萄糖酸盐利用系统
        2.4 转录调控因子GntR
    3 展望
第一章 副溶血弧菌ΔgntR突变株的构建和生物学特性鉴定
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 实验动物
        1.5 引物设计
    2 方法
        2.1 突变株构建
            2.1.1 重组质粒构建
            2.1.2 重组质粒的鉴定
            2.1.3 接合转化
            2.1.4 单交换菌株鉴定
            2.1.5 突变株鉴定
        2.2 回补株和蛋白表达菌株构建
            2.2.1 菌株构建
            2.2.2 Western blot
        2.3 过表达菌株构建
        2.4 毒力实验
        2.5 生长曲线测定,运动性和酸应激试验
        2.6 统计学分析
    3 结果及分析
        3.1 目的基因同源臂的扩增和拼接
        3.2 重组质粒的鉴定
        3.3 同源重组和突变株鉴定
        3.4 回补株和蛋白表达菌株及过表达菌株构建
        3.5 毒力试验
        3.6 生长曲线、运动性试验
        3.7 酸应激试验
    4 讨论及展望
第二章 GntR转录调控葡萄糖酸盐利用系统介导副溶血弧菌肠道定殖的分子机制
    1 材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 RNA-seq分析
        2.2 生物信息学分析
            2.2.1 同源性分析
            2.2.2 信号通路分析
            2.2.3 启动子预测
        2.3 qRT-PCR
        2.4 LacZ报告基因的构建和半乳糖苷酶检测
        2.5 GntR蛋白纯化和凝胶迁移阻滞试验(EMSA)
        2.6 M9培养基补充碳源培养试验
        2.7 过表达菌株生长曲线测定
    3 结果及分析
        3.1 RNA-seq分析
        3.2 生物信息学分析
        3.3 RT-PCR检测副溶血弧菌葡萄糖酸盐利用基因表达情况
        3.4 β-半乳糖苷酶测定
        3.5 凝胶迁移阻滞实验结果（EMSA)
        3.6 M9培养基碳源补充培养试验
        3.7 过表达菌株生长曲线测定
    4 讨论及展望
全文总结
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢



本文编号：3995412