不同调控元件及组合对烟草外源蛋白瞬时表达的效果分析

发布时间：2025-01-17 11:05

　　 植物瞬时表达是一种高效快速获得外源基因表达的方法,该系统主要应用于蛋白互作研究、调控元件功能分析、蛋白亚细胞定位和蛋白制剂合成等方面。为了进一步提高外源基因在瞬时表达体系中稳定表达效果,本研究对瞬时表达载体的多种作用元件及转化条件进行优化。首先,我们在目前最常用的双元表达载体pCambia1300骨架上,分别添加可增强特异性转录和稳定蛋白表达的新的调控元件,构建pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF重组表达载体,并且通过定性和定量方法分析不同元件组合、不同菌液浓度对报告基因eGFP表达的影响。激光共聚焦显微镜观察结果证明3个重组载体可在烟草叶片的细胞膜、细胞质和细胞核中快速表达报告基因;定量PCR分析表明3个重组载体中报告基因在转录表达水平上分别比原pCambia1301-eGFP载体提高了4倍、20倍和28倍;蛋白水平分析表明烟草叶片转化48 h后,pREUR-EF外源蛋白表达量明显高于pREU-EF;并且当菌液注射液浓度OD₆₀₀=0.4左右时,外源蛋白的表达效率最高。此外,我们还进一步把改造后的瞬时表达重组载体运用到双荧光素酶（Dual-...

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【部分图文】：

图1 重组表达载体构建及验证

根据1.2.3实验方法分别将pREU-EF、pREUR-EF和pREUR-p24-EF3个重组表达载体转化烟草叶片，48h后，利用激光共聚焦显微镜分析烟草叶片中报告基因GFP的表达情况。结果（图2）表明，在细胞质、细胞核、细胞膜中均能观察到GFP的表达，初步说明构建的3个瞬时....

图2 重组表达载体侵染后烟草叶片中GFP表达分析

图1重组表达载体构建及验证2.3作用元件组合与目标蛋白表达相关性分析

图4 对比分析不同注射液浓度对pREUR-EF载体中报告基因GFP表达的影响

为验证改造的瞬时表达系统是否可以用于转录调控Dual-Luciferase分析，将拟南芥花药特异表达的转录因子AtMYB80和AMS(ABORTEDMICROSPORES）分别连入pREUR-EF载体，来验证AtMYB80对其下游基因天冬氨酸蛋白酶UNDEAD转录调控关系。Ef....

图5 转录因子MYB80对UNDEAD的调控分析

植物瞬时表达系统具有广泛应用，既可以用于快速研究基因功能，也可以用于获取重组蛋白。已有研究表明，目的蛋白性质、宿主、表达载体系统、密码子偏好性、转化条件等因素都会影响外源蛋白表达[4]。表达载体系统中各作用元件的优化一直是进一步提高外源蛋白的研究热点。在本研究中，我们挖掘和比较文....

本文编号：4027977