MAT2A/MAT2B在小鼠卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的功能研究

发布时间：2025-01-17 20:22

　　哺乳动物卵母细胞成熟及早期胚胎发育受众多信号通路以及转录因子的调控。卵母细胞的成熟需要经过两次减数分裂过程,在减数分裂过程中,MAPK信号通路参与了调控纺锤体的组装和染色体的正常排列。受精后的胚胎即进入着床前发育阶段,该阶段包括两个关键过程,一个是合子基因组激活,该过程是由母源调控向胚胎调控转换的关键时期。早期胚胎发育的另一个重要过程是桑椹胚-囊胚转换,该过程会出现内细胞团以及滋养层的分化。转录因子以及表观修饰因子在这两个过程中发挥着重要作用。发现关键调控因子在卵母细胞成熟或早期胚胎发育中所发挥的作用是揭示发育过程复杂性和系统性的基础。甲硫氨酸腺苷转移酶II(MATII)是哺乳动物体内进行甲硫氨酸代谢的关键复合物,它是由催化亚基α以及调控亚基β组成。其中,α亚基是由MAT2A基因编码而成;β亚基是由MAT2B基因编码而成。该复合物通过催化甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)进而与机体转甲基代谢通路紧密相关,同时SAM也是生物体内甲基基团的最主要来源。MAT2A和MAT2B蛋白广泛分布于生物体的多种细胞类型中,参与了体内众多DNA与组蛋白甲基化修饰。本研究通过筛选及功能分析,对MAT2A...

【文章页数】：122 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
综述部分
    第一章 卵母细胞成熟及早期胚胎发育
        1.1 卵母细胞减数分裂过程及调控机制
            1.1.1 卵母细胞减数分裂过程
            1.1.2 卵母细胞减数分裂调控
        1.2 早期胚胎发育的合子基因组激活
            1.2.1 合子基因组激活的时间
            1.2.2 合子基因组激活的机制
            1.2.3 母源mRNA的翻译
            1.2.4 母源mRNA的清除
            1.2.5 转录调控因子
            1.2.6 染色质重塑
        1.3 囊胚的形成和发育
            1.3.1 致密化和极化的发生
            1.3.2 内细胞团和滋养层的形成
            1.3.3 囊胚期组蛋白修饰
    第二章 MAT2A及 MAT2B的研究进展
        2.1 MAT2A研究进展
        2.2 MAT2B研究进展
        2.3 甲硫氨酸代谢调控
        2.4 甲硫氨酸代谢与DNA甲基化
        2.5 早期胚胎发育的甲硫氨酸供给
        2.6 研究目的和意义
试验部分
    第三章 MAT2A和MAT2B在HEPG2及LO2细胞中的表达和定位
        3.1 材料和试剂
            3.1.1 主要材料
            3.1.2 主要试剂
        3.2 方法
            3.2.1 细胞培养
            3.2.2 RNA提取
            3.2.3 反转录与实时荧光定量PCR
            3.2.4 基因扩增与载体构建
            3.2.5 细胞转染
            3.2.6 细胞免疫荧光染色
            3.2.7 蛋白免疫印迹检测
            3.2.8 统计分析
        3.3 结果
            3.3.1 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2细胞系中的表达
            3.3.2 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2细胞系中的定位
            3.3.3 MAT2A和MAT2B过表达影响其亚细胞分布
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 MAT2B调控小鼠卵母细胞减数分裂成熟
        4.1 材料和试剂
            4.1.1 主要材料
            4.1.2 主要试剂
        4.2 方法
            4.2.1 卵母细胞及受精卵的采集和培养
            4.2.2 卵母细胞显微注射
            4.2.3 胚胎实时荧光定量PCR
            4.2.4 胚胎免疫荧光染色
            4.2.5 MAT2B及 GIT1 过表达载体构建
            4.2.6 细胞培养
            4.2.7 蛋白质免疫共沉淀
            4.2.8 统计分析
        4.3 结果
            4.3.1 MAT2B在卵母细胞期高表达
            4.3.2 敲降MAT2B对卵母细胞成熟的影响
            4.3.3 MAT2B与 GIT1 互作并激活MAPK通路
            4.3.4 U0126 处理对卵母细胞成熟的影响
            4.3.5 敲降MAT2B影响纺锤体排列和母源mRNA降解
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 MAT2A在小鼠合子基因组激活中的功能研究
        5.1 材料和试剂
            5.1.1 主要材料
            5.1.2 主要试剂
        5.2 方法
            5.2.1 细胞培养
            5.2.2 组织RNA提取
            5.2.3 小鼠卵母细胞及胚胎的采集与培养
            5.2.4 mRNA反转录
            5.2.5 蛋白免疫印迹检测
            5.2.6 胚胎显微注射
            5.2.7 胚胎免疫荧光染色
            5.2.8 胚胎实时荧光定量PCR
            5.2.9 体外转录
            5.2.10 胚胎转录活性检测
        5.3 结果
            5.3.1 MAT2A及 MAT2B在小鼠多组织中的表达模式
            5.3.2 MAT2A及 MAT2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎中的表达模式
            5.3.3 免疫荧光检测MAT2A在小鼠早期胚胎中的分布模式
            5.3.4 MAT2A干扰RNA的验证
            5.3.5 敲降MAT2A导致小鼠2-细胞胚胎阻滞
            5.3.6 敲降MAT2A对2-细胞转录水平的影响
            5.3.7 胚胎发育挽救实验
            5.3.8 细胞水平敲降MAT2A后影响组蛋白甲基化修饰
            5.3.9 敲降MAT2A后对2细胞胚胎组蛋白甲基化的影响
            5.3.10 敲降MAT2A后导致2细胞胚胎DNA损伤
        5.4 讨论
        5.5 小结
    第六章 MAT2A在小鼠囊胚发育中的功能研究
        6.1 材料和试剂
            6.1.1 主要材料
            6.1.2 主要试剂
        6.2 方法
            6.2.1 小鼠胚胎获取
            6.2.2 小鼠胚胎培养
            6.2.3 胚胎免疫荧光染色
            6.2.4 胚胎实时荧光定量PCR
            6.2.5 MAT2A催化位点突变载体构建
            6.2.6 体外转录
            6.2.7 胚胎显微注射
            6.2.8 胚胎凋亡染色
        6.3 结果
            6.3.1 环亮氨酸处理对胚胎发育的影响
            6.3.2 环亮氨酸处理对组蛋白甲基化修饰的影响
            6.3.3 甲硫氨酸饥饿培养对胚胎发育的影响
            6.3.4 甲硫氨酸饥饿培养对组蛋白甲基化修饰的影响
            6.3.5 MAT2A催化突变体对胚胎发育的影响
            6.3.6 抑制MAT2A催化活性对胚胎凋亡的影响
            6.3.7 抑制MAT2A催化活性对囊胚细胞数的影响
            6.3.8 抑制MAT2A催化活性对囊胚基因表达的影响
        6.4 讨论
        6.5 小结
全文结论
创新点
不足之处和进一步研究计划
参考文献
附录
致谢
个人简历



本文编号：4028455