Western blot蛋白分析中血清蛋白上样量的研究

　　免疫印迹法(Western blot)是一种半定量分析生物组织蛋白质表达的比较常见的方法，也称做酶联免疫电转移印斑法(Enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB)，因其与Southern首先建立的检测核酸印迹的方法Southernblot相似，所以也被称为Western—blot。它是一种将高分辨凝胶电泳和免疫化学分析技术结合起来的杂交技术。其特点为分析量大、灵敏度高、特异性强等，是检测蛋白质特性表达及分布的常用方法，主要分3个阶段进行，但由于该检测方法步骤较繁琐，实验变量较多，结果不稳定等特性，使得应用该法测定组织中的蛋白浓度时常常会遇到困难，花费大量的人力物力财力和时间去摸索实验条件。其中，总蛋白的上样量直接关系到实验结果的可参照性以及后续步骤的反应灵敏度。目前，关于人血清总蛋白上样量的参考范围罕见报道，为此，本研究将探讨人血清总蛋白上样量的不同对实验结果的影响。

　　1 材料与方法

　　1．1 材料：正常成年人新鲜血清标本(均采自广西医科大学第一附属医院体检科)，预染色标志蛋白质26618(美国Ther—mo公司)。

　　1．2 溶液：PBS缓冲液(20×)(购自生工生物)，BCA蛋白浓度测定试剂盒，SD PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，SDSPAGE凝胶配制试剂盒，sD PAGE电泳液，考马斯亮蓝染色液，考马斯亮蓝染色脱色液(均购自碧云天生物技术研究所)。

　　1．3 仪器：E1x800自动酶标仪(美国Bio—Tek Instruments公司)，96孔板(碧云天生物技术研究所)，制胶器(美国Bio—Rad公司)，电泳仪(美国Bio—Rad公司)，双向电泳系统(美国Bio Rad公司)。

　　1．4 方法

　　1．4．1 BCA法测定样本血清总蛋白浓度。

　　1．4．2 标本处理：将正常成人新鲜血清分装，用1×PBS缓冲液分别将血清稀释2倍、5倍、1O倍及2O倍，按4：1加入SDS—PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，沸水闷煮3 min，10 000r／min离心3 min，常温预冷。

　　1．4．3 制胶：常规方法配置5 浓缩胶以及6 分离胶，胶厚1．0 mm 。

　　1．4．4 上样：等体积上样，每孔上样5L。

　　1．4．5 电泳：恒压电泳，浓缩胶80 mV，分离胶120 mV。

　　1．4．6 染胶：将胶取出置于水平摇床上缓慢摇动，用考马斯亮蓝染色液染色2 h。

　　1．4．7 脱色：倒出染色液，置于水平摇床上缓慢摇动，用考马斯亮蓝染色脱色液脱色过夜，期间更换脱色液3次，直至蓝色背景全部被脱去。

　　1．4．8 拍照：倒出脱色液，用双蒸水洗涤，置于双向电泳系统中，拍照。

　　1．5 实验条件控制：严格地控制实验条件，其中包括：采用比较准确的BCA法测定总蛋白浓度，且多次测量求平均值；溶液配制采用去离子水，胶体的配制采用纯水；相同条件电泳至少重复试验3次；所有操作步骤所使用到的仪器均为同一套装置；所有使用到的溶液均为一次性使用，且现用现配。

　　2 结 果

　　2．1 样本血清总蛋白浓度测量3次，分别为5O．11，5O．04，49．88 g／L。平均蛋白浓度5O．01 g／L。

　　2．2 稀释不同倍数的正常成年人血清总蛋白等体积上样后的电泳结果，见图1。图1显示，血清总蛋白上样量的不同直接影响到目的条带的可辨识度：以原血清(50．01 g／L)上样5“L其中含SDSPAGE蛋白上样缓冲液(5×)1 L，下同，上样总蛋白量200g，电泳所得条带拖带现象严重，在不同分子量处没有明显的单一蛋白条带显现，无法辨识目的蛋白条带，影响后续分析；以2倍稀释血清(25．00 g／L)上样，上样总蛋白量100／xg，拖带现象仍然存在，但已隐约可见若干蛋白条带显现，似稍有弯曲变形；以5倍稀释血清(10．00 g／L)上样 ，上样总蛋白量4O g，电泳后可见蛋白条带清晰，边缘规整无形变；以1O倍稀释血清(5．00 g／L)上样5gI ，上样总蛋白2O g，电泳后蛋白条带清晰；以2O倍稀释血清(2．5Og／L)上样5／L，上样总蛋白1O g，电泳所呈现条带颜色较浅，提示蛋白总量不足，影响后续定量分析的灵敏度。

　　3 讨 论

　　Western blot是一种分析生物组织蛋白质表达比较常见的方法，常常作为筛选出的差异蛋白的后续验证工作。

　　我们针对实验条件阶段比较重要的影响因素，即人血清总蛋白不同的上样量进行研究，比较不同的上样量产生的实验结果。结果显示：当上样的总蛋白量大于100 g时，SDSPAGE凝胶不能很好的区分不同分子量的蛋白质，分离效率下降，影响后续分析操作的进行；当上样的总蛋白量在2o～100 g之间时，分离出的各分子量蛋白质条带清晰，此时分离效率较高；当上样的总蛋白量在l0 g及其以下时，分离出的各分子量蛋白质条带颜色较浅，提示蛋白总量过低，不利于后续分析步骤的进行，笔耕论文新浪博客，降低了测试灵敏度。所以，大多有关Western blot的实验都选用2O～ 100 g这一总蛋白上样量来进行研究，提示总蛋白上样量直接关系着实验的成功与否，与所研究的蛋白种类和组织来源并无直接联系。

　　因此，本实验较好的阐明了Western blot中总蛋白上样量的大小与后续实验的关系，为今后同类实验的开展提供了参考。

　　6 SDS-PAGE凝胶最佳分离范围是分子量在5O～150 ku的蛋白质。本次试验中，笔者选择6 的SDS-PAGE凝胶用以分离人血清蛋白质主要是考虑人血清中5O～ 150ku的蛋白质相对其他分子量区间较少，可以较清楚的显示出由于上样量不同而导致的不同结果，不会因条带过多影响结果的观察。

　　本次试验作者将电泳时的电压固定为浓缩胶8O mV、分离胶120 mV，主要是考虑选取5O～150 ku中间的100 ku分子量蛋白质的参考电压进行跑胶，以利于人血清中各蛋白质组分的分离。