类风湿性关节炎患者外周血hMLH1启动子CpG岛甲基化的初步研究及DNA甲基化的法医学应用探讨

发布时间：2018-03-02 15:34

本文选题：类风湿性关节炎　切入点：DNA甲基化　出处：《河北医科大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种难治性疾病,在我国患病率约为0.3%,是一种全身性自身免疫性疾病,以非化脓性、增生性滑膜炎病变为主,逐渐导致关节软骨的破坏,最后造成关节功能的障碍及多器官、多组织受累。目前,类风湿性关节炎的病因尚未阐明。许多研究认为,遗传和环境因素是主要的病因。现有研究表明,RA患者普遍存在基因组DNA低甲基化,而基因组DNA低甲基化可能使RA患者的某些基因的表达异常,此种机制可能与疾病的发生发展有关。真核基因表达的调控发生于多阶段水平,即基因组、转录、转录后、翻译和翻译后等5个阶段水平。精确调控机制之一是DNA甲基化。这是一种从遗传过程中获得的使DNA发生化学变化的渐进性调控过程,DNA甲基化发生在DNA复制之后,转录之前。其基本过程是在DNA甲基化酶的催化下,从S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上转移甲基到胞嘧啶环的第5位碳原子(或腺嘌呤环的N6位)上(生成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤),从而得到甲基化DNA。DNA甲基化与抗核酶的抗性、细胞防御机制、基因激活与印记、细胞的分化与发育,以及衰老和癌变相关。 DNA错配修复(mismatch repair, MMR)是重要的突变避免系统,它通过校正正常DNA代谢中产生的碱基错配及调节DNA损伤所诱导的凋亡来维持基因组的稳定性。错配修复为细胞准确复制和增殖所必须,若错配修复系统异常,细胞突变频率可增加100倍以上。人体细胞中DNA错配修复反应过程依赖于几种人类MMR基因产物的参与,因此,其中任何一种基因发生突变导致其产物功能的丧失都将造成DNA错配修复功能的异常、缺陷或丧失。目前人类的错配修复(mismatch repair enzyme,MM -R)系统含有9个基因:hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6,其中hMLH1(human mut-l homologue1,hMLH1)是人类错配修复系统中功能最重要的一个基因,主要作用是保持遗传物质的完整性和稳定性,保证DNA复制的忠实性。如果这些错配修复基因功能发生缺陷或活性降低,复制过程中出现的错误不能及时被纠正,就会导致微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI)的出现,使整个基因组不稳定,随机突变率增高,从而引起疾病的发生。有研究显示,hMLH1表达的缺失与此基因启动子胞嘧啶甲基化直接有关。在Leung等的研究中,90 %以上发生hMLH1甲基化的散发性胃癌病例同时伴有hMLH1蛋白的表达缺失,提示甲基化是导致hMLH1基因转录静止的原因。hMLH1启动子甲基化是hMLH1失活的早期分子活动,可导致mRNA或蛋白表达降低,影响hMLH1修复功能的正常发挥,使相关基因突变不能及时有效纠正,最终促使疾病发生。然而,类风湿性关节炎患者hMLH1启动子CpG岛甲基化状态如何,国内外尚未见报道。本实验以人外周静脉血为研究对象,研究hMLH1基因在类风湿性关节炎病人的甲基化情况,并在转录及蛋白水平观察该基因的表达情况。目前,DNA甲基化也是法医学的研究热点。本实验又结合DNA甲基化自身的特点,探讨其在法医学领域的应用前景。方法:采取RA患者外周静脉血,密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞,提取RNA;全血提取DNA及核蛋白。 RT-PCR、Western Blot方法检测外周血hMLH1 mRNA及蛋白表达。所得结果用Gel-pro凝胶分析软件进行半定量分析。采用亚硫酸氢钠(Sodium Bisulfite)方法处理基因组DNA,甲基化特异性PCR(methylation - specific PCR ,MSP)方法检测hMLH1基因启动子甲基化情况。实验分为两组:健康人对照组和RA患者组。SPSS11.5统计分析软件进行分析,行χ2检验或Fisher’-s确切概率法检验和Spearman等级相关分析,均数的比较行秩和检验。结果:1 38例健康人外周血hMLH1 mRNA均有表达,而33例RA患者外周血有17例hMLH1 mRNA是不表达的;38例健康人外周血hMLH1蛋白均有表达,而33例RA患者外周血有22例hMLH1蛋白是不表达的;经秩和检验,RA患者外周血hMLH1 mRNA、蛋白阳性率明显低于健康人(P 0.05)。 2 RA患者组与健康人对照组外周血hMLH1甲基化阳性率分别为90.9%(30/33)和13.2%(5/38),两组间差异有统计学意义(χ2=42.717,P 0.05)。 3本研究发现,30例hMLH1启动子甲基化阳性的RA患者中,有14例mRNA表达阴性;而15例hMLH1 mRNA表达阴性的RA患者中,有14例hMLH1启动子甲基化阳性。30例hMLH1启动子甲基化阳性的RA患者中,有20例蛋白表达阴性;而21例hMLH1蛋白表达阴性的RA患者中,有20例hMLH1启动子甲基化阳性。Western Blot方法检测hMLH1蛋白表达变化与其mRNA表达情况一致。用Spearson等级相关检验对二者进行相关分析,结果hMLH1 mRNA、蛋白表达与hMLH1启动子甲基化呈显著负相关(r=-0.866, P0.01)(r=-0.541, P0.01)。 4 hMLH1启动子甲基化、mRNA及蛋白表达在RA患者不同年龄、性别、RF、ESR、CRP等指标的分布无显著意义(P㧐0.05),即还不能认为hMLH1启动子甲基化,mRNA及蛋白表达水平与RA患者不同年龄、性别、RF、ESR、CRP等指标有相关关系。 5 DNA甲基化图谱有巨大的信息容量和广泛的适用性。借助发育、衰老、肿瘤,以及其它领域的甲基化标记研究成果,可能在亲子鉴定和个体识别上大有作为,为解决一系列法医学问题提供一条全新的途径。结论:类风湿性关节炎患者外周血hMLH1启动子呈异常超甲基化状态。这种异常超甲基化影响了hMLH1转录和蛋白表达,可能参与了RA疾病的发生发展。 DNA甲基化图谱有巨大的信息容量和广泛的适用性。借助发育、衰老、肿瘤,以及其它领域的甲基化标记研究成果,可能在亲子鉴定和个体识别上大有作为,为解决一系列法医学问题提供一条全新的途径。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：D919

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