24个Y-STR基因座荧光标记复合检测体系的建立及其法医学应用

发布时间：2017-07-14 18:27

  本文关键词：24个Y-STR基因座荧光标记复合检测体系的建立及其法医学应用

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【摘要】：人类Y染色体属于性染色体,为正常男性所特有,除拟常染区(pseudoautosomal region, PAR)外,在遗传过程中不发生重组,其序列结构除突变外由父代不变的传递给子代,同一父系人群的Y染色体在理论上相同。Y染色体的这一特性,使其在法医DNA检验和亲权鉴定方面有巨大应用潜力。同时由于其具有男性特异性,在实际办案中,对性侵犯、伤害等案件中提取到的男女混合检材进行鉴定时,Y染色体遗传标记检验技术更有其特殊的价值,能够获得男性个体Y染色体遗传信息同时不受女性成分影响。鉴于以上特点,Y染色体长期以来都是作为重要的研究检验对象被应用于法医物证检验。 针对Y染色体第二代遗传标记——短串联重复序列(STR, short tandem repeats)而进行的荧光标记复合扩增检验,是目前应用最广泛、技术最成熟的Y染色体遗传信息检验技术,具有操作简单、检测信息通量高、结果数字化显示易于存储比对等优点。基于这一技术而开发的各种商业化试剂盒,已经在法医DNA检验鉴定中得到广泛应用。2003年Promega公司推出的PowerPlexTM Y试剂盒在一个反应管中同时扩增12个Y-STRs基因座,其中包括ISFH (International Society of Forensic Haemogenetics)认定的欧洲MHL(最小单倍型,minimal haplotypes loci)的9个基因座及SWGDAM (美国DNA分析方法科学工作组,Scientific Working Group On DNA Analysis Methods)推荐的11个基因座。2004年由ABI公司推出的AmpFISTR Y filerTM试剂盒,可以实现同步扩增检测17个Y-STR基因座。但这些现有的商业化试剂盒主要是按照欧洲人群统计选择的基因座位点,其中不少基因座的多态性在中国人群中比较低,如DYS391在中国人群中多态性小于0.4,加之基因座数量少,造成了系统整体个体识别能力低,在法医鉴定的实际应用中有时会遇到瓶颈,特别是近年随着DNA数据库的发展,比对样本基数的增加,Y-STR作为家系排查的主要比对指标,现有Y-STR检测系统识别率不足的缺点日益突出,影响了其数据库比对效能,出现了如嫌犯与多个不同家系的Y-STR单倍型匹配,造成无法排查的情况,或者由于Y-STR突变,造成家系比对无法确定或误判的情况。 因此,开发一种针对中国人群的多态性高、性能稳定、操作简单和能同时检测更多基因座的Y-STR检测体系,成为我国法医物证检验鉴定的迫切需要。本文根据过去十几年国内外针对中国人群Y-STR的研究,选择针对中国男性的GD(基因多态性,gene diversity)数值较高的Y-STR基因座,建立了24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增检测体系,有效提高Y-STR检测体系对中国人群的鉴别能力和效率,解决了现有Y-STR荧光检验试剂盒识别能力不足的难题。 本文通过查阅文献,从中选取DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、 DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、 DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、 DYS444等未在现有商业试剂盒体系内、在中国人群中基因多态性高(GD0.6)、且等位基因跨度较小的基因座21个,考虑到需要与现有商业试剂盒联用,特地加入DYS635和DYS385a/b三个基因座,同时应用目前最先进的5色荧光标记,将24个基因座分成四组,使用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX分组标记,分子量内标用第五色荧光染料SIZ(橙色荧光,无锡中德美联公司)标记,组成24个Y-STR基因座复合扩增体系。随后通过先对24个基因座的单一扩增条件进行优化,在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上,研究24个基因座复合扩增PCR反应条件,通过实验确定了复合扩增体系的循环参数、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积以及荧光标记引物浓度等,使扩增产物达到平衡、特异的要求,建立稳定、均衡的复合扩增体系,实现同时扩增24个Y-STR基因座。 本文通过编制GeneMapper ID3.2分析文件panel、bins,使用混合单基因座扩增产物方法制作等位基因标准物ladder,使用5色荧光Matrix与SIZ-500内标,建立了基于ABI基因分析仪的自动毛细管电泳检验方法。PCR扩增产物使用3130XL型遗传分析仪进行电泳检测,用软件Foundation data collection收集原始扫描数据,GeneMapper ID3.2进行Y-STR基因分型。对24个Y-STR复合扩增体系的男性特异性、家系稳定性、种属特异性、灵敏度、人体细胞同一性等法医学应用相关指标进行了实验研究,进一步验证了该体系特异性好、性能稳定、反应灵敏。 本文应用建立的24个Y-STR复合扩增检测系统,对146份广东地区无关男性个体进行检测,同时应用AmpFISTR YfilerTM试剂盒进行比较检测,得到Y-STR分型数据后,用直接计数法计算各等位基因频率。基因多态性(gene diversity, GD)及单倍型多样性(haplotype diversity, HD),按公式h=n(1-∑Pi2)/(n-1)计算(n为样本例数,Pi为等位基因频率)。并计算累积的GD值(TGD,相当于常染色体STR评估指标中的累积非父排除率CPE)按公式TGD=1-(1-GD1)(1-GD2)(1-GD3)(1-GD4)...(1-GDn)计算(GDn为各基因座的GD值)。24个Y-STR复合扩增体系共得到145种单倍型,其中144种单倍型出现1次,1种单倍型出现2次,单位点GD值为0.55(DYS531)-0.96(DYS385a/b)HD值为0.99972,TGD值为1-1.88E-14; YfilerTM系统的共得到143种单倍型,其中141种单倍型出现1次,1种单倍型出现2次,1种单倍型出现3次,单位点GD值为0.36(DYS389)-0.96(DYS385a/b), HD值为0.99858,TGD值为1-4.97E-9；24个Y-STR复合扩增体系与YfilerTM系统联用的共得到145种单倍型,其中144种单倍型出现1次,1种单倍型出现2次,HD值为0.99972,TGD值为1-1.066E-20。 研究表明,本文建立的24个Y-STR复合扩增体系稳定、高效、操作简单易用,特异性强,可满足日常法医物证Y-STR检验需要,具有良好的中国人群针对性,系统识别率高于目前最常用的商业AmpFISTR YfilerTM试剂盒,能够很好的解决目前Y-STR商业试剂盒信息量少、个体识别率低的不足。本系统作为Y-STR检验补充手段,应用荧光标记毛细管电泳技术,可应用于目前国内绝大多数法医物证实验室,在法医物证案件检验、亲权鉴定与Y-STR数据库建设具有广泛的应用前景。
【关键词】：Y染色体 短串联重复序列 DYS635DYS385a/b DYS531DYS630DYS622DYS552DYS510DYS449DYS459a/b DYS446DYS443DYS587DYS527a/b DYS460Y-GATA-A10DYS520DYS557DYS522DYS481DYS570DYS444荧光 复合扩增 法医学
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：D919
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 第一章 Y-STR复合扩增体系基因座选择与系统设计18-25
• 1.1 技术路线18-19
• 1.2 位点选择19-21
• 1.3 引物设计和合成21-23
• 1.4 Matrix制作23-25
• 第二章 24个Y-STR复合扩增检测体系的建立25-45
• 一、材料与方法25-30
• 二、结果与分析30-41
• 三、讨论41-45
• 第三章 24个Y-STR复合扩增体系的评价与法医学参数统计45-59
• 一、材料与方法45-50
• 二、结果50-54
• 三、讨论54-55
• 四、应用案例55-59
• 附表59-83
• 全文小结83-85
• 参考文献85-90
• 英文缩略语对照表90-91
• 攻读学位期间成果91-92
• 致谢92-94
• 统计学证明94

【参考文献】

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本文编号：542214