COLD-PCR用于混合检材中微量等位基因富集的可行性

发布时间：2017-07-18 23:13

  本文关键词：COLD-PCR用于混合检材中微量等位基因富集的可行性

  更多相关文章： 混合检材 聚合酶链反应 异源双链 富集

【摘要】：背景来自两个或两个以上个体的混合检材是法医物证检验中经常遇到的疑难检材类型之一。随着高灵敏检测技术、高多态性和性连锁等特殊遗传标记的普及应用,从混合检材中获取证据信息的能力不断提高。但即使对于经验丰富的专家来说,实际案件中一些混合检材的检测和结果解释仍然是一个巨大的挑战。如何对组份含量差异较大的混合检材中的少量成份进行分型,是当前法医DNA分析的难题之一。 目的建立人类Y染色体M175插入/缺失基因座的COLD-PCR(co-ampLification at lower denaturation temperature PCR)技术,比较COLD-PCR与常规PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果,初步探讨COLD-PCR用于法医混合检材中低水平等位基因富集扩增分型的可行性。 方法首先建立人Y-M175基因座的常规PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)银染法分型技术,调查103名河南汉族男性无关志愿者的基因型。用蛋白酶K消化-酚/氯仿法提取插入和缺失型个体的基因组DNA,按不同比例混合制备成混合样品。用梯度保温异源双链消减法测定M175大扩增子(171/166bp)的临界变性温度(critical denaturation temperature,Tc),高分辨率熔解率曲线法(high resolution melting analysis,HRM)测定M175短扩增子(91/86bp)的Tc值。以Tc值为基础,通过在常规PCR的变性和退火之间增加扩增产物杂交和异源双链变性两个步骤,分别建立和优化基于PAGE-银染法(大扩增子)和实时定量法(小扩增子)的COLD-PCR技术,比较常规PCR和COLD-PCR对不同比例混合样品的扩增分型效果。 结果河南汉族Y-M175基因座插入和缺失型的频率分别为0.1650、0.8350。M175大扩增子的Tc值为76.4℃,小扩增子的Tc值为78.4℃,优化后采用的COLD-PCR异源双链变性温度分别为76.4和78.2℃。大扩增子PAGE-银染法,常规PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为5∶1,而COLD-PCR至少可以达到20∶1。小扩增子实时定量法,常规PCR可以有效分型的混合样品的组分比例为16∶1,而COLD-PCR至少可以达到64∶1。 结论使用与常规PCR相同的设备和试剂, COLD-PCR能实现混合样品中微量等位基因的富集扩增,扩大可分型混合检材的范围,改进分型效果,在混合检材的法医DNA分型中有潜在应用价值。
【关键词】：混合检材 聚合酶链反应 异源双链 富集
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：D919.2
【目录】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-9
• 第1章 绪论9-13
• 1.1 法医混合检材9
• 1.2 法医混合检材鉴定研究现状9-11
• 1.2.1 混合成份分离法10
• 1.2.2 性别特异性遗传标记法10
• 1.2.3 高多态性遗传标记结合高灵敏检测技术法10-11
• 1.2.4 混合检材中组织细胞成分差异较大的个体的基因分型11
• 1.3 COLD-PCR 简介11-13
• 第2章 河南汉族 Y 染色 M175 基因座的遗传多态性13-17
• 2.1 背景13
• 2.2 材料13-14
• 2.2.1 仪器13
• 2.2.2 主要试剂13
• 2.2.3 试剂配制13-14
• 2.2.4 样本14
• 2.3 方法14-15
• 2.3.1 Chelex-100 快速提取法14
• 2.3.2 引物设计14-15
• 2.3.3 PCR 扩增15
• 2.3.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离15
• 2.3.5 统计学分析15
• 2.4 结果15-17
• 第3章 普通 PCR 仪下使用 COLD-PCR 检测混合检材中的微量成分17-23
• 3.1 背景17
• 3.2 材料17-18
• 3.2.1 仪器17
• 3.2.2 主要试剂17-18
• 3.2.3 试剂配制18
• 3.2.4 样本18
• 3.3 方法18-21
• 3.3.1 Chelex-100 快速提取法18-19
• 3.3.2 蛋白酶K-酚-氯仿提取法19
• 3.3.3 浓度检测19
• 3.3.4 混合样品准备19-20
• 3.3.5 引物设计20
• 3.3.6 Tc 值的测定20
• 3.3.7 COLD-PCR 扩增20-21
• 3.3.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离COLD-PCR 扩增产物21
• 3.4 结果21-23
• 3.4.1 Tc 值21-22
• 3.4.2 COLD-PCR 及与其富集效果22-23
• 第4章 实时定量 PCR 检测技术与 COLD-PCR 结合检测混合检材中的微量成分23-30
• 4.1 背景23
• 4.2 材料23-24
• 4.2.1 仪器23
• 4.2.2 主要试剂23
• 4.2.3 试剂配制23-24
• 4.2.4 样本24
• 4.3 方法24-26
• 4.3.1 蛋白酶K-酚-氯仿提取法24-25
• 4.3.2 混合样品准备25
• 4.3.3 引物设计25
• 4.3.4 应用实时定量PCR 仪的常规PCR25-26
• 4.3.5 异源双链 Tm 值的HMR 测定26
• 4.3.6 COLD-PCR 扩增26
• 4.4 结果26-30
• 4.4.1 Y-M175 基因座短扩增子PCR 的建立及Tm 值测定26-27
• 4.4.2 Y-M175 基因座短扩增子异源双链Tm 值及COLD-PCR Tc 值的测定27-28
• 4.4.3 COLD-PCR 及其富集效果28-30
• 第5章 讨论30-34
• 5.1 COLD-PCR 的原理30
• 5.2 Tc 值及其测定30-31
• 5.3 COLD-PCR 程序31
• 5.4 Y-M175 基因座COLD-PCR 富集分型效果31-32
• 5.5 EvaGreen 荧光染料的选择32
• 5.6 法医学应用前景与存在的问题32-34
• 第6章 结论34-36
• 第7章 综述混合检材中的微量等位基因富集技术进展36-42
• 7.1 概要36-37
• 7.2 对已知突变选择性和富集的一般方法37-38
• 7.3 对已知突变有较高选择性和富集的方法38-40
• 7.4 根据突变序列富集未知突变40-42
• 参考文献42-48
• 缩略语词汇表48-50
• 附录A 论文50-60
• 致谢60-61
• 攻读硕士学位期间的研究成果61

【参考文献】

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本文编号：560216