基于PDP-MCA的MVP分型技术及其在斑痕鉴别中的应用

发布时间：2017-08-25 21:29

  本文关键词：基于PDP-MCA的MVP分型技术及其在斑痕鉴别中的应用

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【摘要】：【目的】本研究旨在探索新型法医分子斑痕标记及其检测技术。首先建立一种简便快速的基因组甲基化可变位点(Methylationvariableposition,MVP)分析技术--快速甲基化敏感性限制酶消化后PCR链融解曲线法(postfast-methylationsensitiverestrictionenzymedigestionPCRmeltingcurveanalysis,PDP-MCA)，然后用该技术调查一组织特异性MVP在法医学常见斑痕中的甲基化状态，评价其作为斑痕标记的可行性。 【方法】PDP-MCA技术的建立与评价：以文献报道的差异甲基化区(differentiallymethylatedregion,DMR)为模型，在MVP位点两侧设计一组产物Tm值各不相同的引物。在同一反应管内，顺次进行基因组DNA的FastdigestMSRE酶切、复合扩增和链溶解曲线分析，Rotor-Gene2.0.2.4软件分析数据生成MCA图谱，Origin8软件进行峰参数计算和统计分析，根据各片段融链峰的面积和峰高比例判断相应MVP位点的甲基化水平。同时用PDP-MCA和传统的MSRE-PCR技术检测相同的样品，验证方法的可行性。组织特异性MVP作为法医斑痕标记的可行性：用上述PDP-MCA技术调查法医学常见斑痕(血斑、唾液斑、精斑各20份，月经血斑、阴道液斑各12份)MVP位点的甲基化状态，分析比较不同斑痕的MCA/HRM图谱，提取每个片段解链前后的标准荧光变化值，，用StatistiXL软件对样本数据进行判别分析，初步确立各种斑痕的判别方程。 【结果】(1)Tm值相差2℃以上的4个片段，复合扩增、复合MCA分析可以生成分离良好的融链峰，链融解曲线法可以代替电泳实现快速闭管检测。利用甲基化敏感性的FastDigest内切酶，可以在同一反应管内实现快速酶切、扩增和MCA检测，不同细胞有不同的MCA图谱。与对照管相比较，组成酶切管MCA图谱的各MVP峰位置不变，峰高峰面积等参数呈组织特异性变化。这种变化与传统的MSRE-PCR得到的结果一致，所反映的组织细胞甲基化特征也与文献报道相符。当前实验条件下，0.5ng的基因组DNA即可获得稳定的MCA图谱。加入的基因组DNA在0.5~20ng之间，不影响图谱的特异性。(2)用PDP-MCA检测，血斑、唾液斑、精斑、月经血斑、阴道液斑各有其特异性的MCA图谱，HRM差异曲线可以直观的分出男性生殖斑痕(精斑)、女性生殖斑痕(月经血斑和阴道液斑)、非生殖斑痕三大类。对样本数据进行判别分析，得到6个判别方程：Y血＝215.889X1＋351.518X2＋184.426X3＋187.220X4－8944.600，Y唾液＝218.104X1＋357.846X2＋185.441X3＋189.631X4－9160.218，Y精液＝211.353X1＋336.697X2＋181.563X3＋182.828X4－8479.036，Y阴道液＝212.469X1＋348.672X2＋180.079X3＋189.103X4－8702.051，Y月经血＝214.026X1＋349.480X2＋182.364X3＋189.059X4－8812.421, Y对照＝209.004X1＋337.309X2＋178.322X3＋187.022X4－8367.215。训练样本的总体判别准确率为97.2%，除血斑(83.3%)外，其他斑痕的准确率均为100%。 【结论】(1) PDP-MCA可以实现多个MVP的一步单管、闭管检测，是一种简便快速的DNA甲基化分析技术；(2)所调查的5个MVP片段(MAGE1、14-3-3σ、MCJ、TIMP、HOXA5)在常见法医斑痕之间存在甲基化差异，可以作为候选的分子斑痕标记；(3)用PDP-MCA联合检测MAGE1、14-3-3σ、MCJ三个MVP片段，可以鉴别血斑、精斑、唾液斑、月经血斑及阴道液斑。
【关键词】：DNA甲基化 斑痕鉴别 链融解曲线分析 甲基化敏感性限制酶
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：D919
【目录】：

• 摘要2-4
• ABSTRACT4-8
• 第1章 前言8-16
• 1.1 法医斑痕鉴别8
• 1.2 斑痕鉴别技术8-10
• 1.3 DNA 甲基化与斑痕鉴别10-12
• 1.4 PDP-MCA 技术简介12-16
• 第2章 基于 PDP-MCA 的 MVPs 检测技术16-26
• 2.1 背景16-18
• 2.1.1 仪器16-17
• 2.1.2 试剂17
• 2.1.3 主要试剂的配制17-18
• 2.1.4 样本18
• 2.2 方法18-21
• 2.2.1 酚∶氯仿∶异戊醇法基因组 DNA 提取18-19
• 2.2.2 DNA 浓度纯度测定19
• 2.2.3 引物设计19-20
• 2.2.4 模板的选择20
• 2.2.5 单管 PDP-MCA 法20
• 2.2.6 传统 MSRE-PCR MCA 法20-21
• 2.2.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物片段21
• 2.2.8 数据分析21
• 2.3 结果21-26
• 2.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶图谱21-22
• 2.3.2 MCA 图谱22-25
• 2.3.3 数据分析25-26
• 第3章 常见斑痕 MVPs 标记的调查与评价26-40
• 3.1 背景26
• 3.2 材料与方法26-29
• 3.2.1 公共数据库与检索系统26
• 3.2.2 仪器26-27
• 3.2.3 试剂27
• 3.2.4 样本27
• 3.2.5 样本基因组 DNA 的提取、纯化和浓度的检测27-28
• 3.2.6 引物设计28
• 3.2.7 单管 PDP-MCA 法28-29
• 3.3 组织斑痕鉴定数据分析29
• 3.4 结果29-40
• 3.4.1 斑痕的特异性 MCA 图谱29-31
• 3.4.2 图谱特异性的影响因素31-32
• 3.4.3 结果判别32-34
• 3.4.4 判别分析34-40
• 第4章 血痕鉴别技术进展40-48
• 4.1 概要40
• 4.2 斑痕鉴别的意义40-48
• 4.2.1 预实验41-42
• 4.2.2 确证试验42-43
• 4.2.3 新的检测技术43-45
• 4.2.4 展望45-48
• 第5章 讨论48-54
• 5.1 PDP-MCA 技术的原理48
• 5.2 可行性48-49
• 5.3 添加剂的选择49
• 5.4 优势与问题49-50
• 5.5 MCA/HRM 图谱分析50-51
• 5.6 StatistiXL 软件判别分析51
• 5.7 DNA 甲基化斑痕标记的优势51-54
• 第6章 结论54-56
• 参考文献56-60
• 缩略语词汇表60-61
• 附录61-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士学位期间的研究成果64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：738303