烟气诱导DNA损伤的高通量筛查及迷迭香的化学防护机制研究

发布时间：2020-07-14 00:06

【摘要】：污染的空气和水体中存在多种化学致癌物,如苯并芘、黄曲霉毒素、有机氯、磷农药和亚硝胺等,这些环境污染物会诱导DNA损伤,对细胞的生存和生长产生影响,甚至诱发各种肿瘤。而来源于燃料燃烧的烟气则是空气污染的主要原因之一,例如汽车尾气、垃圾焚烧烟气、火灾烟气、烹调烟气等。烟气成分复杂,因燃料的种类、燃烧方式而异,危害性也与颗粒成分和大小有关。有害烟气短期大剂量暴露会造成急性中毒,而长期低剂量暴露对人体健康的影响是广泛的,往往和DNA损伤和修复、细胞氧化应急、炎症反应、肿瘤发生等有相关性,有的还会影响神经系统,但这种危害不容易防范,往往会被人们所忽略。因此,对环境烟气进行危害识别、发展降低烟气危害的有效方法、增强人们的防护意识,具有重要的现实意义。卷烟烟气是一种典型的环境烟气,目前在已经鉴定出的约4800多种化学物质中就有69种已被确定为致癌物,部分化合物属于肿瘤促进因子或辅助致癌物,例如烟碱、CO、HCN、烟草特有亚硝胺等。相对于其他来源的烟气例如烹饪产生的油烟气、垃圾焚烧等产生的混合气溶胶形式的污染物来说,卷烟烟气总粒相物(Total Particulate Matter,TPM)具有释放稳定,有害化学物质明确、捕集方法科学规范、样品来源便捷、容易控制、可反复试验、长期低剂量暴露等显著优势。因此,本论文将卷烟烟气总粒相物作为环境烟气的模式样品,研究如何高通量筛查烟气诱导的遗传损伤以及如何运用化学防护剂的方法来有效抵抗烟气危害,最后从转录组和蛋白水平探讨防护机制。本论文内容分为三部分:第一部分是研究建立TPM诱导DNA损伤的三类高通量筛查方法,为环境烟气和污染水体的危害识别和化学防护剂的筛选提供简便方法;第二部分是化学防护剂迷迭香的筛选研究,再通过细胞毒性试验和建立的TPM诱导DNA损伤的高通量筛查方法对迷迭香多种成分进行防护功效验证,筛选到细胞毒性低、防护效果强的成分迷迭香酸;第三部分是从转录组水平对迷迭香酸的化学防护机制进行研究,确定其关键信号通路并进行验证,最终绘制迷迭香酸防护卷烟烟气损伤的信号调控网络。本研究第一部分建立了DNA损伤标记物γH2AX高通量检测、染色体损伤标记物微核试验自动化检测、细菌回复突变检测这三类DNA损伤高通量筛查方法。首先采用高内涵细胞仪,通过双染料Hoechst和标记γH2AX抗体的FITC来识别细胞的背景和γH2AX的荧光,提高了检测的准确性,建立起高内涵检测DNA损伤标记物γH2AX的方法。研究结果表明:随着TPM暴露浓度的增加,γH2AX单个细胞核平均荧光强度呈上升趋势,当TPM暴露浓度为80?g/mL时,γH2AX单个细胞核平均荧光强度达到最高;当暴露时间在12h,不同剂量TPM诱导的γH2AX单个细胞核平均荧光强度最强。其次对细胞扫描分析技术与细胞微核的定量识别方法进行研究,建立了流式细胞仪法、计算机图像分析系统检测法及高内涵筛选法,并对14个品牌卷烟的卷烟TPM样品进行微核检测,与人工显微镜检法获得的微核率具有良好相关性,这三个方法均可用于卷烟烟气诱导体外细胞微核的高通量检测。研究还对细菌回复突变(Ames)微量波动法在TPM致突变检测中的进行了改良和优化使其可以快速检测TPM诱导的基因突变。最后将体外微核流式细胞仪法和Ames试验微量波动法应用到污染水体危害识别中,成功识别出污染水体样品的致突变性危害。天然化学防护剂需要具备无毒或低毒和靶点明确的特点。本研究第二部分采用永生化肿瘤细胞A549和HepG2、TP53突变型(p53-/-+S+Ras)及野生型(P53-/-+V+Ras)细胞及永生化正常细胞CHO和HPF,考察了迷迭香几种成分和提取物包括鼠尾草酸(CA)、鼠尾草酚(CS)、熊果酸(UA)、迷迭香酸(RA)、迷迭香精油(RO)和迷迭香水溶性提取物(RE)的毒性作用,寻找对正常细胞无毒性作用的剂量范围。结果表明:CA在CHO细胞中IC_(50)值最低,其次是HPF细胞,说明CA对正常细胞毒性相对要大;CS却是在肿瘤细胞A549和HepG2中IC_(50)值最低,而RA、RO和RE对正常细胞(CHO和HPF)的毒性作用较低。进一步采用Annexin V/PI双染色法考察细胞凋亡情况。结果表明:CA、CS、UA、RA导致CHO细胞的坏死比率显著高于凋亡比率,但RA导致细胞坏死的比率只有CA、CS和UA的一半,且对细胞凋亡的影响相对小。由此可得出结论:鼠尾草酸、鼠尾草酚、熊果酸对细胞毒性较大,迷迭香酸、迷迭香精油和迷迭香水溶性提取物的细胞毒性相对较小。本研究第二部分采用MTT细胞毒性方法、Ames试验微量波动法试验和细胞微核试验高内涵法来验证和筛选迷迭香的防护功效和有效成分。防护作用的研究方法为先用迷迭香保护细胞24小时,再用TPM暴露细胞24小时。结果表明:在MTT细胞毒性试验中,CA、CS、UA在70μg/mL剂量范围内,对TPM诱导的毒性作用明显大于防护作用,而RA在90μg/mL剂量范围内,对TPM诱导的细胞毒性具有明显的防护作用,RO和RE在150μg/mL剂量范围内,仍有一定的防护作用,且在HPF细胞上的防护作用比CHO细胞更为明显。在细菌回复突变微量波动法试验中,TPM诱导TA98回复菌落数为47孔/50孔,CA、CS和RA在最大剂量0.8mg/50孔时,可使TA98诱发的回复菌落降低到正常自发回变范围,且有明显的剂量依存关系,因而具有很强的抗突变作用,而UA、RO和RE的抗突变性表现相对弱一些。进一步采用体外微核试验高内涵法验证低毒且有效的成分RA对TPM诱导遗传毒性的防护作用,结果表明:RA剂量为20-80μg/m L剂量范围内,TPM对经过RA预保护的HPF细胞,所诱导的微核数比起未经保护的细胞显著性降低,说明RA对TPM诱导的染色体损伤有显著的防护作用。在第三部分里对已经确定迷迭香酸化学防护作用机制进行了探索,我们首先采用RNA-Seq分析手段,对六组样品进行了转录组测序、GO分析和GSEA基因富集分析,这六组样品分别为单纯TPM暴露6h组(TS)、单纯TPM暴露24h组(TL)、单纯细胞对照组(CC),单纯RA预处理组(RC)、RA预处理后加TPM暴露6h组(RTS)、RA预处理后加TPM暴露24h组(RTL)。结果表明:TPM6h短期暴露(TS)显著激活的BP、CC和MF的功能基因条数大于TPM24h长期暴露(TL);RA保护TPM6小时所引起的生物学事件主要是与细胞早期应激相关,而RA保护TPM24小时所引起的生物学事件主要是与DNA修复、染色体相关,并富集到了G2M检查点、血管生成以及IL6-JAK-STAT3信号通路。GSEA分析结果显示差异基因被富集到多个基因集中,根据这些基因集我们推测RA对TPM诱导的细胞损伤的防护作用可能通过如下几个方面发挥作用:第1是调控细胞内氧化反应,如过氧化物酶体、氧化应激反应、ROS通路;第2是调控细胞内代谢水平,如胆固醇同态、雌激素应答、胆汁酸代谢、糖原、脂肪酸代谢;第3是调控细胞连接和运动性,如细胞顶面连接;第4是调控细胞生长和凋亡,如P53通路,有丝分裂纺锤体、G2M检查点,DNA修复、KRAS信号通路和炎症反应。第5是调控细胞命运,如肌细胞生成和KRAS信号通、P53通路。结果显示差异表达基因多次被富集到P53通路,而P53通路对DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、肿瘤形成都有调控作用,故我们推测RA很可能通过调控P53通路来发挥作用。在接下来的研究中我们在细胞水平和蛋白水平验证了RA对TPM诱导细胞损伤的防护作用。通过检测ROS、线粒体膜电位、细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和DNA损伤标记物γH2AX,明确了TPM诱导的各种细胞损伤以及RA的防护作用。结果显示:TPM能够剂量依赖地引起细胞增殖抑制,能够剂量依赖地引起细胞凋亡和坏死,能够诱导线粒体内活性氧(ROS)的产生、线粒体膜电位下降,引起细胞的氧化损伤,并能迅速诱导γH2AX聚集到细胞核,还促使细胞周期阻滞于G0/G1期。而RA预处理则可以明显降低TPM诱导的细胞增殖抑制、细胞凋亡、ROS产生、DNA损伤以及细胞凋亡水平。我们的P53信号通路相关蛋白的Western Blot检测结果显示:TPM能够激活P53信号通路、下调SIRTl,增加p21蛋白的表达,使Bax、Bcl-2表达量增大;而RA预处理,可以抑制ROS的产生,SIRTl表达上调,MDM2表达下降,影响P53蛋白的磷酸化和乙酰化。总之,从转录组结果和P53信号通路相关蛋白的Western Blot结果推测:迷迭香酸可能抑制ROS产生并激活SIRTl信号通路,通过p53蛋白的磷酸化和乙酰化调控MDM2途径以及SIRTl途径,抑制下游的凋亡蛋白Bax和切割caspase表达来有效地抑制TPM诱导的氧化损伤;RA还能通过增加细胞周期阻滞p21蛋白表达来使细胞获得足够的自我修复的时间从而抵抗TPM的损伤。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X701
【图文】：

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检测与图像分析 HCS 的各种相关参数，并扫描获取 Hoechst 通道及 FITC成后使用 HCS 上配置的分析软件进行分析，计算单个细通道的单个细胞核平均荧光值。用 Hoechst 通道的单个照，比较γH2AX 单个细胞核平均荧光值的变化，用其评果与分析γH2AX 检测的数据分析异构酶抑制剂依托泊苷诱导 CHO 细胞的γH2AXs 分析软件对所获取的数据进行分析，获取的部分图如下a b

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图 2.2 体外微核分析试剂盒法检测 CHO 细胞微核的原理图.2.1.2 有核细胞微核的激光扫描全自动检测方法原理下图为美国 CompuCyte 公司 LSC 工作原理图。

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23图 2.2 体外微核分析试剂盒法检测 CHO 细胞微核的原理图2.2.1.2 有核细胞微核的激光扫描全自动检测方法原理下图为美国 CompuCyte 公司 LSC 工作原理图。图 2.3 LSC（CompuCyte 公司）工作原理图

【参考文献】