多氯联苯降解菌的筛选及其降解性能研究

发布时间：2020-07-25 10:06

【摘要】： 多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)是一类典型的、分布广泛的持久性有机氯代污染物,其组成复杂,理论上有209种同类物和异构体。近20年来,生物降解PCBs的研究一直是环境科学技术领域的热点,获得能够降解不同种类PCB同类物的高效好氧降解菌株是其中需要解决的关键问题。本论文首先以相似物为底物从变压器油污染点筛选获得了一株降解PCBs的新菌株,经分子生物学鉴定和生理生化指标鉴定,确认该菌株为肠杆菌属(Enterobacter sp.),命名为LY402。进一步以Aroclor系列的PCBs混合物为研究对象,系统研究了该菌株对不同PCB同类物的降解能力及其影响因素;采用气相色谱-质谱联用技术对其中间代谢产物进行了鉴定;利用同源分析进行引物设计,通过PCR等方法对LY402中的PCB降解酶基因进行了全面解析,获得了如下研究结果: (1)Enterobacter sp.LY402休眠细胞在30℃对浓度为2mg/L的Aroclor1242、1254、1260的降解率分别能够达到87.3%、60%和29.1%。LY402能够降解高浓度的PCBs,LY402对100mg/LAroclor1242的6天降解率能够达到60%,说明该菌株具有很强的抗污染物毒性的能力。 (2)Enterobacter sp.LY402对3mg/L的Aroclor系列(1242:1254:1260=1:1:1)混合物生物降解动力学研究表明,在无外加碳源的无机盐液体培养基中,经过6天降解,91个色谱峰中的51个消失,23个色谱峰的峰面积有不同程度的降低,10余个色谱峰的峰面积未见明显变化,75%Aroclor系列混合物被有效降解。 (3)不同PCB同类物的生物降解速率相差很大,氯取代数量和取代位点是影响生物降解速率的主要因素。在氯取代数量影响PCB同类物生物降解率的考察中发现,2-5个氯取代的所有PCB同类物均能被LY402快速有效降解;95%的6氯代PCB异构体能够被有效降解;75%的7氯代PCB异构体能够被降解,其降解效果虽不如6氯代的PCB异构体高,但仍很明显;8氯、9氯取代的PCB同类物几乎未被降解。LY402对PCBs的降解总体上遵循随着氯取代数量的增多,生物降解速率降低的规律。研究发现,氯取代位点对PCB同类物和异构体的生物降解率有很大影响。Enterobacter sp.LY402既能降解邻位氯取代的PCBs,也能降解对位氯取代的PCBs,但对位氯取代(4,4＇和3,3＇,4,4＇)对生物降解具有明显的抑制作用。在112个PCB同类物中,有13个未被有效降解,其中的12个含有3,3＇,4,4＇氯取代位点,包括具有共平面或类共平面结构的高毒性PCBs。与已经报道的PCBs高效降解菌株相比,Enterobacter sp.LY402的PCBs降解效果总体上优于其它菌株。 (4)Enterobacter sp.LY402降解PCBs代谢产物的研究表明,LY402在降解PCBs的过程中会产生不同取代位点的氯代苯甲酸,发现在降解过程中存在显著的好氧脱氯现象。同时证实LY402对PCBs的代谢产物氯代苯甲酸也有一定的降解作用,可以部分降解单氯代氯苯甲酸,但对两个氯以上取代的氯代苯甲酸降解效果不明显。 (5)对Enterobacter sp.LY402降解PCBs的系列降解酶基因(biphenyl-catabolic gene,bph)进行了解析。发现在LY402的细胞中含有一个约20Kb的质粒,PCB降解相关基因均位于质粒上。根据降解基因的同源性设计引物、通过PCR扩增并对产物测序,获得了LY402中bph基因簇的几乎全部基因序列(10.65Kb),通过序列比较分析发现,LY402的bph基因簇与已发表的PCB高效降解菌株Pseudomonas sp.LB400的相关序列高度同源,只在联苯双加氧酶的小亚基发生了一个碱基的突变(C~(70)→T),该碱基突变导致一个氨基酸的变化(Thr~(24)→Ile)。但LB400中的bph基因簇是处于1400Kb的巨型质粒上,由于两个菌株的种属亲缘性相差较远,对于二者PCB降解基因上的高亲缘性目前还缺乏准确的解释。 (6)表面活性剂作为降解菌LY402的碳源能够明显促进PCBs的生物降解。在相同条件下,在以2g/L的生物表面活性剂月桂酸蔗糖酯和非离子表面活性剂Tween-80为碳源的生长细胞体系中,LY402对4mg/L Aroclor1242的12小时降解率分别达到75.4%和64.7%,比相同情况下的以联苯为碳源的降解体系降解率分别高出20.6%和9.9%。研究了月桂酸蔗糖酯对不同组成Aroclor系列PCBs生物降解率的影响。在2g/L月桂酸蔗糖酯生长细胞体系中,LY402对2 mg/L的Aroclor1242、1254、1260的生物降解率分别为98.5%、79.9%和64.5%,比相同情况下的休眠细胞体系分别提高了12.2%、19.9%和35.5%,尤其使6氯、7氯等高氯取代PCB同类物的生物降解率得到了显著提高。上述研究结果表明,Enterobacter sp.LY402是迄今发现的好氧降解效率最高、降解PCB同类物的种类最广的降解菌之一,对PCBs生物降解动力学和降解机理的研究使我们对微生物的降解能力有了更深入的认识,为进一步基因改造菌株、提高PCBs污染点的生物强化修复效率提供了依据。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：X703
【图文】：

双加氧酶,六聚体,联苯,氯代苯甲酸

共代谢产物氯代苯甲酸，除LB400对2-氯代苯甲酸和2，3一氯代苯甲酸株不能将其进一步矿化，需要与其它可降解氯代苯甲酸的细菌协同作化。大多数氯代苯甲酸是通过氯代儿茶酚途径被降解的[40](如图1氧菌共代谢PCBs的相关降解酶研究CBs好氧生物降解能力影响最大的是降解途径中的第一个酶，即联。联苯双加氧酶属于形eske型非血红素铁N心(H)P依赖型加氧亚基组成，分别是铁硫蛋白(IsP)a大亚基(BphAI)、铁硫蛋白、负责电子传递的铁氧还蛋白(BphA3)和铁氧还蛋白还原酶(p亚基对底物的识别、结合和选择性非常重要。如虽然LB400和相差20个氨基酸，但两者的底物范围却相差很大，特别是335，(按照KF707双加氧酶编号)对酶的选择性最为重要147]。

铁离子,单核,底物,氯代苯甲酸

多氯联苯降解菌的筛选及其降解性能研究

BphB同四聚体的结构

【引证文献】