甲烷氧化混合菌群的富集培养及其治理瓦斯工艺研究

发布时间：2020-10-10 02:35

　　甲烷氧化菌能在温和条件下特异的利用甲烷,具有应用于甲烷减排和煤矿瓦斯治理的潜力。本论文在对我国典型煤矿土壤的甲烷氧化菌进行分子生态学分析的基础上,确定甲烷氧化混合菌的富集培养策略,获得高效利用甲烷的稳定混合菌群,对其特性和功能进行研究,实现大规模发酵培养,并在实验室和煤矿现场进行了瓦斯治理实验。用多种分子生态学方法解析了瓦斯煤矿土壤中的甲烷氧化菌及相关微生物的组成信息。该样品含有大量的甲烷氧化菌及甲基氧化菌,其中甲烷氧化菌以Ⅰ型为主,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅹ型甲烷氧化菌的含量分别为78.6%、7.1%和14.3%。分别以甲烷气和人工瓦斯气作为唯一碳源对土壤样品进行好氧选择性传代培养。富集过程中甲烷和乙烷的消耗能力得到显著强化,总细菌的多样性逐渐减少,Ⅰ型甲烷氧化菌则得到富集,20代以后菌群结构和甲烷去除能力趋于稳定。研究了两种气体条件富集的混合菌群的特性,包括菌体形态、生长特性、代谢特性和微生物群落结构。驯化后Ⅱ型甲烷氧化菌数量增加,人工瓦斯气富集的混合菌菌群更丰富。混合菌比纯菌的甲烷消耗能力更强,且无代谢产物积累。菌群间的协同作用能有效避免产物抑制,有利于菌群结构和功能的稳定。对两种条件得到的混合菌的功能进行了系统分析。其在甲烷浓度为3~50%时都有较好的去除效果,最高可达241 ml CH4 h~(-1) OD660~(-1) (L culture)~(-1)。在20~42oC都能有效的去除甲烷。对H_2S、CO和SO_2等毒性气体有很强的耐受性。混合菌保藏可用4oC充甲烷密封保存法、-80oC冻存菌体法和-80oC添加石蜡油冻存法。以甲烷气富集的混合菌为对象,研究了甲烷氧化混合菌的大规模发酵培养。成功开展了5L-300L和5L-600L的放大发酵实验。混合菌在放大培养时,生长速度稳定,且随着发酵逐级放大,消耗甲烷能力以及菌群结构都能够保持稳定。在实验室模拟煤层、生物过滤实验中研究混合菌去除甲烷的能力,并在河南三个矿井进行现场中试,将制备的菌液注入煤层并达饱和,甲烷去除效果显著,说明富集的甲烷氧化混合菌有在煤矿中治理瓦斯的应用潜力。
【学位单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：X172
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章文献综述
    1.1 课题背景
    1.2 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶
        1.2.1 甲烷氧化菌的分类及特性
        1.2.2 甲烷单加氧酶的基因与蛋白
        1.2.3 甲烷单加氧酶的催化特性
    1.3 甲烷氧化菌的应用研究热点
        1.3.1 甲烷氧化菌的培养工艺研究
        1.3.2 甲烷氧化菌的工业生物催化研究
        1.3.3 甲烷氧化菌的生物修复研究
        1.3.4 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的基因工程研究
        1.3.5 甲烷氧化菌的分子生态学研究
    1.4 甲烷氧化菌在工业应用中存在的问题
    1.5 应用甲烷氧化菌治理煤矿瓦斯
        1.5.1 甲烷氧化菌在温室气体减排中的应用
        1.5.2 煤矿瓦斯治理现状及生物治理的可行性
    1.6 论文的主要研究内容
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究框架
第2章从煤矿土壤富集培养甲烷氧化混合菌
    2.1 引言
    2.2 实验材料与方法
        2.2.1 DNA 提取和纯化
        2.2.2 PCR 扩增16S rRNA 和功能基因
        2.2.3 核酸限制性片段长度多态性分析
        2.2.4 变性梯度凝胶电泳
        2.2.5 DNA 序列分析
        2.2.6 培养基及富集条件
        2.2.7 甲烷、乙烷的检测方法
    2.3 煤矿土壤的特性分析
    2.4 煤矿土壤中甲烷氧化菌群落的功能基因解析
        2.4.1 基于功能基因pmoA 的 RFLP 分析
        2.4.2 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析
        2.4.3 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析
    2.5 不同条件从煤矿土壤富集甲烷氧化混合菌
        2.5.1 对甲烷和乙烷的消耗能力的变化
        2.5.2 富集过程的细菌群落变化
        2.5.3 富集过程的I型甲烷氧化菌群落变化
        2.5.4 富集过程的II型甲烷氧化菌群落变化
    2.6 本章小结
第3章甲烷氧化混合菌的特性分析
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 菌种及培养方法
        3.2.2 显微镜和扫描电镜观察
        3.2.3 MMO 酶活测定
        3.2.4 代谢分析
    3.3 甲烷氧化混合菌的微生物群落分析
        3.3.1 基于16S rRNA 的RFLP 分析
        3.3.2 基于功能基因pmoA 的 RFLP 分析
        3.3.3 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析
        3.3.4 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析
    3.4 甲烷氧化混合菌的生长特性研究
        3.4.1 菌体形态
        3.4.2 生长状况与干重曲线
        3.4.3 甲烷消耗与MMO 酶活
    3.5 甲烷氧化混合菌的代谢分析
    3.6 甲烷氧化混合菌的协同作用机理
    3.7 本章小结
第4章甲烷氧化混合菌的功能分析和保藏
    4.1 引言
    4.2 实验材料与方法
        4.2.1 评价方法
        4.2.2 保藏方法
    4.3 对不同浓度甲烷的消耗能力
    4.4 不同温度下对甲烷的消耗能力
    4.5 对毒性气体的耐受性
    4.6 对煤矿瓦斯中甲烷的去除能力
    4.7 甲烷氧化混合菌的保藏方法研究
    4.8 本章小结
第5章甲烷氧化混合菌的大规模发酵研究
    5.1 引言
    5.2 实验方法与装置
        5.2.1 种子培养
        5.2.2 5L 发酵罐培养
        5.2.3 40L-300L 二联发酵罐
        5.2.4 100L-600L 二联发酵罐
    5.3 混合菌在5L 发酵罐的培养研究
        5.3.1 生长特性
        5.3.2 甲烷去除能力
        5.3.3 菌群变化
    5.4 混合菌放大发酵研究
        5.4.1 5L-40L-300L 放大发酵
        5.4.2 5L-100L-600L 放大发酵
    5.5 本章小结
第6章甲烷氧化混合菌治理煤矿瓦斯应用研究
    6.1 引言
    6.2 在实验室模拟煤层中去除甲烷
    6.3 应用生物滤器去除甲烷
    6.4 河南煤矿掘进煤层注入试验
        6.4.1 禹州市军阳矿业矿井中试
        6.4.2 禹州市神火集团矿井中试
        6.4.3 河南永锦能源有限公司矿井中试
    6.5 甲烷氧化混合菌治理瓦斯的前景分析
    6.6 本章小结
结论
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

【参考文献】