不同来源菊粉酶基因在Saccharomyces sp.W0菌株中的表达和乙醇生产

发布时间：2017-12-04 17:22

  本文关键词：不同来源菊粉酶基因在Saccharomyces sp.W0菌株中的表达和乙醇生产

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【摘要】：菊粉(Inulin)是一种果聚糖(Fructan),主要由果糖分子聚合而成,末端含有葡萄糖分子,聚合度一般为2-26。菊芋根块干重中的菊粉占有很大比重,而我国菊芋作为一种非粮作物种植范围很广,因此工业中主要以菊芋作为原料生产菊粉。菊粉酶可以水解菊粉分子的β(2→1)键,微生物是生产菊粉酶的最主要来源。当前我国的能源需求不断扩大,我国已经是世界上最大的生物乙醇生产和消费的国家,发展以非粮作物生产生物乙醇是我国应对能源增长的手段之一为了能使可产酒精Saccharomyces sp.W0菌株可以直接利用菊粉生产生物乙醇,本研究中利用表达质粒pMIRSC11将来自C. membranifaciens subsp. flavinogenie W14-3菌株的外切菊粉酶基因W14-3-INU1在Saccharomyces sp.WO的尿嘧啶缺陷型菌株W12d中进行整合表达,并筛选到一株重组菊粉酶活性比较高的重组子W14,该重组子在YPI液体培养基中,经过28℃培养72 h,其菊粉酶活力可以达到20.3±0.2 U/ml。通过对W14-3-INU1基因在W0菌株和转化子W14的表达量通过荧光定量的方法进行分析,观察到W14-3-INU1基因在转化子W14中进行了表达。为了利用该重组子以菊粉为底物生产酒精,通过对其发酵条件进行优化,得到该重组子在150 mL发酵体系中的最佳发酵条件为：10%的接种量,自然pH值和25%的菊粉添加量。通过以25%浓度的菊粉为底物发酵120 h时后,最后产酒精浓度可达到12.8%(v/v,20℃),不携带外切酶基因的菌株所产酒精为9.8%(v/v,20℃),比不含有菊粉酶基因的Saccharomyces sp.WO菌株提高30.61%。通过在2.0-L发酵体系中以菊粉为底物生产酒精,通过120 h的发酵后,其酒精含量达到最高为13.4%(v/v,20℃),总糖和还原糖在120 h发酵之后利用率分别为92.0%和99.1%。说明该转化子W14能够将菊粉充分地利用来生产生物乙醇。为了得到能够获得具有更高菊粉酶活力的菌株和获得更高的生物乙醇产量,本研究将菊粉内切酶基因和外切酶基因在同一宿主Saccharomyces sp. WO共同表达。利用另外一种表达质粒pMIDSC31与来自Aspergillus niger strain F4菌株的内切菊粉酶基因EinuA一起构建表达载体pMIDSC31-EinuA,然后与含有外切酶基因W14-3-INU1的表达载体pMIRSC11-W14-3-INU1一起在Saccharomyces sp.W0进行中表达。通过测定不同转化子的菊粉酶活力,得到了一株重组菊粉酶活性比较高的重组子WE85,该重组子在YPI液体培养基中培养72 h后其菊粉酶活力可以达到33.9±0.2 U/mL,比只含有外切菊粉酶基因的转化子W14提高了67.00%。同时,通过将该转化子WE85在150mL的含有25%(w/v)的菊粉的发酵体系中进行120 h的发酵之后,得到的酒精浓度为13.8±0.3%(v/v),总糖利用率为92.4±0.1%(v/v),还原糖利用率为98.8%(v/v)。
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ223.122;Q78

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本文编号：1251749