Ig样结构域对嗜热酯酶Tn0664的影响

发布时间：2017-12-07 18:05

  本文关键词：Ig样结构域对嗜热酯酶Tn0664的影响

  更多相关文章： Ig样结构域 CAP结构域 嗜热酯酶 重组酶

【摘要】：酯酶是一类能够催化酯键水解的酶类,主要由CAP结构域和催化结构域两部分构成。一般情况下,CAP结构域由α螺旋和一些loop环构成,是酯酶家族中序列相似性较低的部分;催化结构域则为典型的α/β水解酶折叠,是酯酶家族中的保守区域。CAP结构域对酯酶性质的影响是目前研究的热点。本文从嗜热细菌Thermotoga naphthophila RUK-10的基因组中扩增出嗜热酯酶Tn0664的基因并对其蛋白质序列进行分析比对,结果表明,不同于普通酯酶的N端CAP结构域,Tn0664具有独特的免疫球蛋白(Ig)样N端结构域。通过构建敲除N端结构域的突变酶TnδIg0664和将Ig样结构域替换成普通CAP结构域的重组酶E50664和E400664,来研究Ig样结构域对酯酶Tn0664性质的影响。实验结果表明,酯酶Tn0664的最适底物为对硝基苯酚丙酸酯,最适反应温度为95℃,最适pH值为9.5,对底物对硝基苯酚辛酸酯的Km值为4.5×10-4 m M,kcat值为477 s-1,而TnδIg0664的最适底物为对硝基苯酚醋酸酯,最适反应温度为80℃,最适pH值为10.0,对底物对硝基苯酚辛酸酯的Km值为4.7×10-2 m M,kcat值为39 s-1,切除Ig样结构域后酶与底物的亲和性和催化效率同时降低,剩余酶活为4.4%,说明Ig样结构域参与了酶的催化过程,对底物识别过程起着调控作用。重组酶E50664和E400664的最适底物均为对硝基苯酚辛酸酯,最适温度分别为60℃和50℃,最适pH值为10.5,对底物对硝基苯酚辛酸酯的Km值分别为3.9×10-1 m M和7.0×10-2 m M,kcat值分别为504 s-1和1192 s-1,更换CAP结构域后的酶表现出更加广泛的底物特异性和较低的嗜热性,催化效率均高于去Ig样结构域的突变酶。这些结果充分说明了Ig样结构域对维持酶的嗜热性,底物特异性和活性有重要作用。酶的稳定性实验结果表明,Tn0664在70℃,80℃和90℃条件下的半衰期分别为60 h,37 h和12 h,TnδIg0664在70℃和80℃下的半衰期分别为6 h和10min,在90℃条件下保温10 min,酶的剩余活力已不足10%;在pH稳定性实验中,Tn0664,E50664和E400664的酶活在处理1 h和24 h的情况下没有明显的变化,而突变酶TnδIg0664的酶活则降低了约60%,由此可以看出Ig样结构域在维持酶的稳定性方面扮演了重要角色。本文的研究工作初步阐释了Ig样结构域对酯酶Tn0664的意义,同时,利用结构域重组方式构建的新酶也表现出不同的性质,丰富了酯酶的种类。但是,作为独特存在于酯酶结构中的Ig样结构,其分子水平作用机制还需进一步探索,以便给出更加完善的作用模型。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55

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本文编号：1263255