骆驼天然单域重链抗体库的构建及抗莱克多巴胺纳米抗体的初步筛选

发布时间：2017-12-08 06:17

  本文关键词：骆驼天然单域重链抗体库的构建及抗莱克多巴胺纳米抗体的初步筛选

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【摘要】：骆驼免疫系统里的一种天然缺失轻链的仅由重链组成的抗体,称为重链抗体或纳米抗体。相对于传统抗体,纳米抗体独特的结构,使其具有分子量小、可溶性好等特性,在病原的检测、食品安全分析等领域被普遍应用。纳米抗体与抗原结合功能与全长抗体同等,可以取代全长抗体用于RAC的免疫学检测,建立可靠性高的免疫学检测方法。本实验的研究目的在于构建骆驼天然重链抗体文库,并筛选出抗RAC的噬菌体颗粒。莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)是一种属于苯酚胺类的β-肾上腺素兴奋剂。RAC易在动物组织中积聚残留,人食用后可造成头疼、胸闷等毒副作用。目前,欧盟、中国等组织和国家都将RAC列为违禁物,禁止其在畜禽身上使用。因此,畜产品中莱克多巴胺的快速准确检测对食品安全具有重要意义。本论文的主要内容和结果如下:1.骆驼天然单域重链抗体噬菌体展示文库的构建与鉴定从健康骆驼外周血淋巴细胞中提取其RNA,经鉴定RNA完整性良好。以RNA为模板,反转录为cDNA,PCR扩增骆驼重链抗体可变区基因,将酶切后基因与噬菌粒载体pCANTAB5E连接后电转化至大肠杆菌TG1。经文库鉴定得知,抗体库重组率大约是90%,计算得抗体文库的库容量约为107cfu/mL。随机挑取单克隆测序,抗体库多样性良好,可用于后续淘选研究。2.莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定利用1,4-丁二醚法制备RAC-OVA人工抗原,混合酸酐法制备RAC-BSA人工抗原,分别经紫外光谱扫描法和SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定,合成的人工抗原的吸收峰出现偏移现象,且偶联物的分子量比载体蛋白的分子量偏大。证明人工抗原RAC-OVA、RAC-BSA偶联成功。3.抗莱克多巴胺纳米抗体重组噬菌体的筛选与鉴定用人工抗原RAC-BSA从噬菌体展示抗体库中筛选出能表达抗RAC特异性纳米抗体的重组噬菌粒,取筛选得到的阳性噬菌体扩增纯化后,诱导表达获得的可溶性重组纳米抗体粗提物,并进一步通过ELISA检测纳米抗体粗提物,经鉴定其具有抗原结合能力。综上所述,本实验已成功构建骆驼天然单域重链噬菌体展示抗体库,并从抗体库中筛选出抗莱克多巴胺的噬菌体颗粒,为抗莱克多巴胺纳米抗体的表达和RAC的免疫学检测奠定了基础,天然噬菌体抗体库的构建为后续淘选其他针对特定抗原的纳米抗体奠定了基础。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：1265341