嗜盐古生菌温和病毒SNJ1溶源裂解调控机理的研究

发布时间：2017-12-08 08:20

  本文关键词：嗜盐古生菌温和病毒SNJ1溶源裂解调控机理的研究

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【摘要】：对于温和病毒而言,其溶源-裂解选择的调控贯穿着整个病毒侵染过程的生命周期。人们对细菌病毒的溶原裂解调控机制已有较深入的理解,但对极端环境下古生菌病毒-宿主相互作用关系,特别是针对嗜盐古生菌病毒却知之甚少。SNJ1是存在于嗜盐古生菌Natrinema sp.J7-1细胞内的温和病毒,其衣壳结构呈现二十面体球状,含脂质内膜,具有独特的分类地位,是新的病毒科——球脂状病毒科(Sphaerolipoviridae)β属的模式病毒株。与早期发现的两株头尾状且基因同源性极高的嗜盐古生菌温和病毒φH和φCH1相比,SNJ1无论是在结构还是基因排布上都与它们存在明显差异。SNJ1的前病毒以环状双链质粒DNA(pHH205)的形式存在于宿主细胞中。它不能侵染J7-1菌株,但侵染不携带质粒的Natrinemasp.CJ7菌株时可产生噬菌斑,也可以较高比例形成溶源菌,即从CJ7菌株变成J7-1菌株,说明存在着一个控制该病毒选择溶源或裂解途径的调控机制。类似于经典的温和病毒λ噬菌体,SNJ1也可被丝裂霉素C(Mitomycin C,MMC)诱导进入裂解途径,但其基因组中的预测蛋白均与已知的CⅠ、CⅡ类似蛋白无同源性,暗示它可能采取新的策略来建立或维持溶源状态。实验室前期曾基于SNJ1病毒基因组和大肠杆菌复制区成功构建了E.coli-Natrinemasp.J7全长穿梭载体pYC-S。本研究对CJ7/pYC-S用MMC进行处理,发现其裂解液能在CJ7铺制的双层平板上同时产生数量不一的空斑和浊斑,而携带野生型SNJ1前病毒(pHH205)的J7-1菌株经同样处理后形成的噬菌斑均为浊斑;之后对浊斑病毒、空斑病毒及野生型SNJ1病毒的侵染能力进行比较,发现空斑病毒裂解宿主的能力较野生型SNJ1显著增强,而浊斑病毒的情况则与野生型SNJ1类似,对宿主细胞生长的影响也无明显变化;挑取一定数量的这两种噬菌斑进行测序鉴定,发现空斑病毒均部分缺失了 orf4区域(293-499bp处),而浊斑病毒基因组的orf4区域则保持完整。转录起始位点分析实验排除了该区域对下游基因转录情况的直接影响,说明orf4或其编码产物可能与病毒早期溶源裂解的选择调控有关。进一步利用pYC-S载体进行orf4基因的定向改造,发现携带orf4缺失突变体的CJ7菌株经MMC诱导后均只能产生空斑病毒,证明orf4确实与SNJ1溶源裂解调控过程直接相关;此外,和野生型SNJ1病毒感染CJ7菌株时可以较高比例选择走溶源化道路的现象不同,经多次尝试均未分离筛选到空斑病毒感染CJ7菌株形成的溶源菌,说明orf4很可能是决定SNJ1早期溶源/裂解选择过程中溶源化建立的关键因素。另一方面,利用基于J7染色体复制区构建的Natrinemasp.J7-E.coli穿梭载体pFJ6在CJ7-F菌株(pyrF缺失的尿嘧啶缺陷菌株)中表达orf4基因。发现该重组菌株(CJ7/pFJ6-1-656)和J7-1菌株一样,可彻底抑制SNJ1的侵染,无法形成噬菌斑。进一步对orf4进行分段表达,发现仅表达gp4N端33个氨基酸即可赋予宿主对SNJ1病毒产生"免疫性"。有意思的是,SNJ1感染重组菌株CJ7/pFJ6-1-656时可筛选到同时携带PFJ6-1-656和pHH205的溶源菌株。对该溶源菌株的质粒稳定性和病毒诱导释放曲线进行测定发现,orf4基因的额外表达并未对SNJ1前病毒基因组(PHH205)的复制、DNA的分配及病毒的释放产生明显影响,侧面反映orf4可能是通过抑制病毒进入细胞从而帮助宿主建立超感染免疫。综上所述,本研究通过一系列遗传学实验,最终发现SNJ1基因组上orf4(499-293)的预测编码大小为68个氨基酸的蛋白gp4同时参与了 SNJ1早期溶源途径的选择和宿主超感染免疫性的建立。进一步对J7-1经MMC诱导前后orf4及其相邻基因的转录水平进行检测,发现orf4和orf5-6的转录水平并不受MMC的影响,且orf4诱导前后的转录水平一直处于高水平的状态;另外,基于PSI-BlastP和HHpre对于orf4预测编码蛋白gp4进行序列分析,发现gp4与一些转录调控因子及毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TAsystem)系统中的抗毒素蛋白具有序列相似性。不仅如此,gp4和这些相似性蛋白的二级结构均被预测或证实包含SpoVT-AbrB结构域,类似于AbrB-like Swapped Hairpin结构,由一个α螺旋连接一对β发夹结构组成。因此,gp4很有可能是控制SNJ1进行溶源、裂解选择的关键调控因子,甚至是一个对病毒多个基因进行调控的全局调控因子。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q93

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本文编号：1265697