阿魏酸酯酶基因的克

发布时间：2017-12-08 09:22

  本文关键词：阿魏酸酯酶基因的克隆、改造及生物信息学分析

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【摘要】：阿魏酸酯酶属于半纤维素降解酶系,它可以将多糖-多糖、多糖-木质素之间的酯键水解,有利于水解细胞壁的组成物质多糖释放木质素。阿魏酸酯酶在生物能源、食品、制浆造纸和生物合成等行业具有广泛的应用价值。目前,阿魏酸酯酶的酶活力、反应条件和稳定性等方面仍有较大提升空间,并且市场上成熟的商品化阿魏酸酯酶制剂还比较少,没有大规模的应用到工业生产中,因此对阿魏酸酯酶基因的克隆、改造的研究有很重要的意义。酶蛋白的异源表达常形成包涵体且不具有生化活性。本研究通过在棒曲霉阿魏酸酯酶基因加入融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)标签等,提高大肠杆菌BL21(DE3)表达产物的溶解性,并对其活性进行分析。研究表明,加入融合标签的阿魏酸酯酶对阿魏酸乙酯均无分解能力,但加入麦芽糖结合蛋白(MBP)的阿魏酸酯酶具有D型阿魏酸酯酶的表征。目前,这些添加融合标签的重组质粒还在进一步的研究之中。本研究还利用生物信息学软件对栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola23)的双功能木聚糖酶-阿魏酸酯酶的理化性质、二级结构、三级结构以及进化历史等进行深入分析。通过同源比对确定木聚糖酶和阿魏酸酯酶的功能区段,为后续研究提供理论基础。此外,为了获得活力高、稳定性好的阿魏酸酯酶,本研究成功从瘤胃普雷沃氏菌基因组中克隆双功能木聚糖酶-阿魏酸酯酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并对双功能木聚糖酶-阿魏酸酯酶酶学性质进行初步研究。结果表明,该酶的最适温度在35℃-40℃之间,最适PH 7.0左右,各种溶液对酶活的影响均不相同。为了明确双功能酶的催化机制和结构,本研究通过生物信息学分析和PCR技术将双功能酶的两个部分克隆并对其酶学性质进行研究。结果表明,酶的最适条件基本没有发生变化,但分离后的单功能酶活力均下降,阿魏酸酯酶部分丧失分解阿魏酸乙酯能力。为了提高阿魏酸酯酶活性和稳定性,本研究还对阿魏酸酯酶进行了改造,分别在序列前加入17个氨基酸、信号肽和截短一个结构域。对改造后的阿魏酸酯酶的酶学性质也做了研究。结果表明,截短后的阿魏酸酯酶丧失生物学活性;加长17个氨基酸、信号肽的阿魏酸酯酶的最适条件基本无变化,而酶活性进一步降低。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55;Q811.4

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本文编号：1265874