腺苷酸激酶ak4敲除对雄性斑马鱼生殖细胞凋亡的影响

发布时间：2017-12-12 16:12

  本文关键词：腺苷酸激酶ak4敲除对雄性斑马鱼生殖细胞凋亡的影响

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【摘要】：生命的延续和发展依赖于生物的繁殖。有关生殖发育的研究受到越来越多的关注。斑马鱼作为一种常用的模式生物,受精和发育均在体外进行,方便研究。除此之外,作为脊椎动物,斑马鱼的基因同人类基因的功能相似,组织器官的结构同源。因此,在现代生命科学研究的各个方面广泛使用。腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)是遍及于植物、动物和微生物体内的一种单体酶,在需要高水平腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)的细胞中大量存在。近年来,人们在细胞凋亡过程中发现有AK的迁移和酶活的变化,且AK缺陷与人类很多疾病的发生都有直接关系。有文献报道,人的AK1-4、6-7均表达于睾丸和附睾,AK5仅表达于附睾;AK6还表达于精子尾部。但在雄性生殖系统中AK的作用目前知道的还很少。实验室合作者前期研究发现,在人类弱精症患者中,AK相关基因表达异常。因此,本论文采用CRISPR/Cas9技术,敲除斑马鱼ak4,研究其对雄性生殖系统中ATP含量和AMP/ATP比例的影响以及对雄性生殖细胞凋亡的影响,为进一步治疗与此相关的疾病提供理论支持。通过序列比对和进化分析,发现斑马鱼各Ak彼此之间的序列一致性仅为8.5%,说明斑马鱼ak家族基因在序列、功能上有很大分化。qPCR技术分析斑马鱼各ak在胚胎发育早期和成体各组织器官的表达,发现斑马鱼ak7a既有有母源表达,又有合子表达;其他ak以合子表达为主;在精巢中表达的ak有ak1、ak4、ak6、ak7a、ak7b、ak8和ak9。由此明确了 ak各亚型在斑马鱼的表达情况,为针对特定的功能研究进行基因敲除提供了线索。随后采用CRISPR/Cas9技术,成功敲除斑马鱼腺苷酸激酶ak4基因,并筛选到纯合突变体后代。用HPLC方法测定精巢中ATP、ADP、AMP的含量及AMP/ATP比例,结果表明,突变体精巢中ATP含量显著减少,AMP含量未发生明显变化,AMP/ATP比值升高。说明精巢中细胞的能量状态发生了显著变化。用TUNEL和FCM检测,发现突变体精巢中细胞凋亡增多。结合其他文献和本实验结果,推测细胞中这种能量变化导致了 ak4突变体雄性生殖细胞凋亡。在8 h、24 h分别检测,都发现ak4雄性突变体后代存活率下降,死亡率上升,推测是由于ak4突变后,细胞凋亡增加导致精子质量下降所致。突变体胚胎在发育早期下包慢,卵黄大,色素浅,身体短,发育滞后。结合ak4在早期发育中的表达,这显示ak4也参与了早期胚胎发育过程。另外,还采用CRISPR/Cas9敲除了斑马鱼ak6和ak7a基因,制备了 F0代突变体。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;Q492

【参考文献】

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1 王明霞;任雷鸣;王红芳;;细胞外ATP和腺苷及其受体与细胞凋亡[J];中国药理学通报;2006年09期

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本文编号：1283119