黏细菌、古菌漆酶序列筛选及其部分重组酶酶学性质分析

发布时间：2017-12-12 18:31

  本文关键词：黏细菌、古菌漆酶序列筛选及其部分重组酶酶学性质分析

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【摘要】：漆酶是一种具有广泛潜在应用价值的多铜氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化,因此,黏细菌中关于漆酶的研究也较少。古菌常被发现生活在各种极端自然环境下,这些特殊的生活习性和与此相关的潜在生物技术开发前景,一直吸引着人们的注意。在此,我们采用生物信息学的方法,综合应用BLAST和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行比对,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进一步筛选,获得候选目的漆酶序列。我们通过构建进化树的方法,对获得的候选目的漆酶进行分类,按照序列特征与类别从中挑选了 9条目的漆酶序列进行重组表达验证。以2-6甲氧基苯酚(DMP)和丁香醛连氮等底物检测重组酶的催化活性,成功获得7个黏细菌重组蛋白具有漆酶催化活性。针对其中1个对DMP具有较高氧化活性的重组酶(来自纤维素堆囊菌,命名为rSC-2)。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质,最适反应温度为60℃,最适反应pH范围在中性到偏碱性范围,在60℃孵育1h保留50%以上剩余酶活。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorang ium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中的重组表达。同时,我们利用同样的信息学方法对古菌进行了全蛋白质组的比对分析,得到47个候选目的漆酶序列。从中挑选5个在大肠杆菌Escherchia coli BL21(DE3)中重组表达后没有漆酶活性,分析序列发现序列中存在糖基化位点、双精氨酸转运途径和预测断裂位点,需要翻译后修饰而不能在大肠杆菌系统中异源表达得到活性蛋白,转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中表达,并用功能板筛选也发现了 ABTS漆酶活性的重组酶。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55;Q93

【参考文献】

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本文编号：1283539