指导RNA偶联转录调控因子抑制基因表达及双链断裂引起DNA重组的研究

发布时间：2017-12-12 21:40

  本文关键词：指导RNA偶联转录调控因子抑制基因表达及双链断裂引起DNA重组的研究

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【摘要】：储存在基因组中的遗传信息经转录、翻译,进而形成蛋白质分子的过程,我们称之为基因表达。这种翻译产生的蛋白质分子具有生物活性。植物体内各种酶和功能蛋白质都是由其相应的结构基因表达产生。真核生物的转录起始通常需要转录因子的共同参与,过程比原核生物复杂得多。首先,转录起始过程由RNA聚合酶Ⅱ与转录因子共同参与,它们通过结合形成转录起始复合体而发挥作用。就目前研究来看,对基因表达调控的研究已经成为一种重要手段,可以帮助我们去了解特定基因的功能。对特定基因表达的调控方法有很多种,但主要方式有:RNA干涉(RNA interference,RNAi)法、DNA结合蛋白,如锌指蛋白(Zinc Finger,ZF)、CRISPR/Cas技术。在本研究中,我们建立了一种简单、精确和高效的新型抑制植物基因表达的技术体系。将绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)、指导RNA(guide RNA,gRNA)和编码转录抑制因子与噬菌体外壳融合蛋白的三种基因构建到植物表达载体中。利用农杆菌侵染本氏烟草叶片,介导植物瞬时表达。研究显示GFP基因在烟草叶片中的表达受到显著抑制,抑制率达到41.5%。此系统可运用于对其他基因进行基因调控,由于只需要改变gRNA,而其他组成原件保持不变,因此该技术具有操作简单及具有广泛适应性等特点。该技术可以精确抑制植物基因组中基因表达,为基因表达抑制提供了有效的工具。近年来,基因组编辑技术研究逐步发展起来,这是一种可以进行DNA定点突变的方法技术。一种新的、高效的基因组编辑技术方法能够实现特异性位点的突变,要求人为设计简单方便,并且对目的基因序列具有高度灵活的选择性。目前,锌指核酸酶技术、RNA介导的规律成簇间隔短回文重复序列系统和类转录激活因子样效应物核酸酶等基因组编辑技术得到广泛应用。它们都可以精确地在DNA双链的特定位点上产生切口,进而实现基因插入、缺失和碱基替换等突变。相比于传统的基因组编辑技术,这些新的基因编辑技术不仅能够实现对DNA进行定点修饰,而且还能应用到更多的物种上,可以使大大提高基因定点突变的效率。此外,其载体构建成本相对低、时间相对较短,使基因组的定点突变成为可能。然而,最近的研究发现,脱靶效应在这些系统中普遍存在。本研究构建了一种新型的定点基因组转录调控技术,即指导RNA偶联转录调控因子(gRNA and Tethered Transcriptional Regulator,GRATR)。我们发现,在GRATR系统介导的抑制基因表达的研究中,与双链DNA碱基互补配对的gRNA能够引起DNA的断裂并使DNA发生重组。将绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)、指导RNA(guide RNA,gRNA)两种基因片段构建到植物表达载体中。利用农杆菌侵染本氏烟草叶片,介导植物瞬时表达。研究显示GFP基因在烟草叶片中的表达受到显著抑制,抑制率达到36.4%。只需要改变gRNA,此系统可运用于对其他基因的定点突变。
【学位授予单位】：聊城大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：1284092