猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价

发布时间：2017-12-15 09:27

本文关键词：猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价

【摘要】：猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种以引起仔猪腹泻、呕吐以及脱水为特征的猪肠道传染病病毒。2012年,Woo等首次在我国香港的猪群中发现PDCoV,随后该病于2014年2月在美国暴发。据报道,在我国的江西、安徽、江苏、湖北、哈尔滨等地区的部分猪场中检测到PDCoV,该病毒已经成为严重影响我国猪群健康的新发病原体。因此,建立一种快速、准确的血清学诊断方法,对PDCoV进行血清学调查是非常必要的。冠状病毒的N蛋白高度保守,因此本研究选择PDCoV N蛋白作为诊断抗原。为了获得PDCoV N蛋白,本研究根据Genbank发表的PDCoV N基因的核苷酸序列,根据大肠杆菌密码子的偏嗜性,人工合成了PDCo V N基因。合成的基因分别连接至pET-32a和pGEX-6p-1原核表达载体,经IPTG诱导表达,成功获得了重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N,经鉴定重组蛋白均为可溶性蛋白。Western blot结果显示,重组蛋白均能被PDCoV阳性血清识别,具有良好的抗原性,能够作为检测PDCoV抗体的诊断抗原。为了建立检测PDCoV抗体的血清学诊断方法,本研究以纯化的重组蛋白pET-32a-PDCoV-N作为诊断抗原建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法(rPDCoV-N-ELISA)。本研究通过反应条件优化、cut-off值的确定、特异性试验、重复性试验以及ROC曲线分析进行了rPDCoV-N-ELISA可行性评价。试验结果表明,rPDCoV-N-ELISA的最佳抗原包被浓度为1μg/mL,最佳一抗稀释度为1/200,最佳二抗稀释度为1/7 500,最佳抗体孵育时间为均为1 h。特异性试验表明,该抗原不与其他常见7种猪病的阳性血清发生交叉反应。重复性试验得出,批间批内重复性试验的变异系数均小于15%。ROC曲线分析得出,与western blot相比,该方法的敏感性和特异性分别为100%和90.4%。上述试验结果表明,rPDCoV-N-ELISA具备检测PDCoV抗体的可行性。本实验室利用rPDCoV-N-ELISA对收集自黑龙江省部分地区的319份猪血清样本进行血清学调查发现,样本的PDCoV抗体总阳性率为11.59%(37/319),表明该病在黑龙江省部分地区呈现较低的流行性。本研究获得的PDCoV重组蛋白pET-32a-PDCoV-N和pGEX-6p-1-PDCoV-N均可以被PDCoV阳性血清识别,可以作为检测PDCoV抗体的诊断抗原。本研究利用重组蛋白pET-32a-PDCoV-N建立的检测PDCo V抗体的间接ELISA方法,与western blot相比,具有较高的敏感性和特异性,可以为PDCoV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.651

【参考文献】

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