磁性核—壳生物高分子纳米颗粒的制备及用于β-葡萄糖苷酶（CfGlu1B）的分离纯化和活性改进

发布时间：2017-12-15 12:29

本文关键词：磁性核—壳生物高分子纳米颗粒的制备及用于β-葡萄糖苷酶（CfGlu1B）的分离纯化和活性改进

【摘要】：本研究合成了一种“核-壳”结构的磁性生物高分子纳米颗粒,将其用于分离纯化融合蛋白及改良蛋白的活性。以带六聚组氨酸标签的CfGlu1B(台湾家白蚁三种内源性β-葡萄糖苷酶中的一种)为对象,研究了该磁性纳米颗粒在分离纯化CfGlu1B和改进酶活性方面的应用,结果如下:(1)通过蒸馏沉淀聚合法制备的磁性纳米颗粒Fe_3O_4/PMG/IDA-Ni~(2+),通过透射电子显微镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、热重分析仪(TGA)、X射线衍射仪(X-ray)以及强磁场震动样品磁强计(VSM)表征磁性纳米颗粒的形态结构、组成和磁性能等理化特征。结果显示Fe_3O_4/PMG/IDA-Ni~(2+)为“核-壳”结构,直径约为350 nm;相应官能团的特征吸收峰明显;饱和磁化量为20.7emu/g,对外加磁场响应灵敏。(2)研究磁性纳米颗粒在分离纯化融合蛋白CfGlu1B(His-Cf Glu1B)方面的应用。首先确定带His标签的CfGlu1B融合蛋白和磁性纳米颗粒的特异性结合,对比目标磁性纳米颗粒以及中间产物颗粒分别与含His-CfGlu1B蛋白的溶液孵育后的SDS-PAGE和溶液中剩余酶活的变化,确定了His-CfGlu1B特异性结合目标磁性纳米颗粒,不会与中间产物颗粒发生非特异性吸附;其次比较该磁性纳米颗粒与商业化纯化材料的纯化效率的差异,选取两种商业化纯化材料(GenScript)无磁性镍柱High Affinity Ni-NTA Resin和(Thermo Scientific)磁性镍柱HisPurTM Ni-NTA Magnetic Beads,纯化后His-CfGlu1B的比活和总活力回收率结果显示三种材料的纯化效率相当,纯化后CfGlu1B的比活如下:无磁性镍柱(45.09 U/mg)略大于磁性纳米颗粒(42.61 U/mg),略高于磁性镍柱(40.86 U/mg);蛋白CfGlu1B的总活力回收率如下:无磁性镍柱(77.3%)大于磁性镍柱(63.2%),高于磁性纳米颗粒(60.6%)。(3)研究磁性纳米颗粒作为固定化酶载体对酶动力学参数的影响。研究了固定化过程的三个主要影响因素:His-CfGlu1B蛋白量/载体(μg/mg)、孵育时间和孵育温度。三个因素分别对固定化His-CfGlu1B活性作曲线,得出固定化最佳条件:蛋白量/载体是120μg,孵育时间30 min,孵育温度25℃。在最佳条件下测定磁性纳米颗粒的固载量约为60 mg/g。固定化对His-CfGlu1B动力学参数影响的研究结果表明,固定化His-CfGlu1B(Km=3.4±0.4 mM)对底物p-NPG的亲和力高于游离的(Km=4.2±0.3 mM),固定化His-CfGlu1B的催化效率(Kcat/Km=13.5±0.7 S-1 mM-1)略低于游离的(Kcat/Km=14.0±0.7 S-1 mM-1)。(4)研究磁性纳米颗粒作为固定化载体在活性改良方面的应用价值。首先研究载体和His-CfGlu1B酶的结合稳定性,固定化的酶在4℃放置20天后未能检测到载体和His-CfGlu1B酶的分离,说明His-CfGlu1B酶与磁性纳米颗粒间的结合稳定。其次研究固定化酶的热稳定性,固定化His-CfGlu1B在60℃温育30分钟后,残留活性是原活性的75%,而游离His-CfGlu1B在60℃温育30分钟后,残留活性检测不到;固定化His-CfGlu1B在25℃放置20天后酶活剩余70%,而游离His-CfGlu1B在25℃放置20天后酶活剩余20%,这说明固定化His-CfGlu1B的热稳定性远高于游离的酶。最后检测了固定化His-CfGlu1B酶可重复使用次数,固定化酶在11次重复使用后仍维持约70%的原酶活性,改善了游离酶难以重复利用的缺点。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TB383.1;Q814.1

【参考文献】

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