人参糖基转移酶基因UGT-D-3OH-1的克隆及原核表达

发布时间：2017-12-20 02:11

  本文关键词：人参糖基转移酶基因UGT-D-3OH-1的克隆及原核表达　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：人参作为人参属植物的代表,在中国已有上千年的应用历史,是传统的名贵中草药,为五加科多年生草本植物。人参皂苷是人参乃至人参属植物的主要活性成分,存在于人参的根、茎、叶等部位。人参皂苷Rh2是一种具有很高药用价值的单体人参皂苷,尤其在肿瘤的预防及治疗方面有着广泛的应用,但人参皂苷Rh2的生产工艺一直未取得突破。研究表明人参皂苷Rh2由一系列的代谢合成,经历角鲨烯,2,3-氧化角鲨烯,达玛烯二醇,原人参二醇,最终原人参二醇在糖基转移酶UGT-D-3OH-1的催化作用下生成人参皂苷Rh2。目前原人参二醇已经可以通过发酵法实现工业化生产,本研究旨在利用现代分子生物学技术,构建糖基转移酶UGT-D-3OH-1的原核表达工程菌,利用原核表达系统的高效表达特性,通过发酵法生产糖基转移酶UGT-D-3OH-1,以实现用酶工程的方法转化原人参二醇生成人参皂苷Rh2。本研究通过基因工程的方法,以实验室继代培养的人参发根为实验材料,克隆得到了人参发根中的糖基转移酶基因UGT-D-3OH-1,将该基因与原核表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)分别进行连接,得到的重组质粒再转入宿主菌E.coli BL21(DE3),得到原核表达工程菌BL21-UGT-22b和BL21-UGT-28a。工程菌经IPTG诱导表达,目的蛋白SDS-PAGE电泳检测,包涵体复性,酶活测定,最终得到了具有酶活的目的蛋白,在体外以原人参二醇为底物通过酶催化反应生成人参皂苷Rh2,并进一步地对工程菌的发酵条件进行优化,为实现工业化生产人参皂苷Rh2奠定坚实的基础。本研究的主要内容如下:(1)以培养了28d的人参发根为实验材料,提取获得了人参发根的总RNA,通过RT-PCR技术反转录出人参的c DNA,根据NCBI数据库中已知的序列以及引入酶切位点的需求,设计UGT-D-3OH-1基因的特异性引物,再以c DNA为模板,最终成功克隆出了糖基转移酶基因UGT-D-3OH-1。(2)将糖基转移酶基因UGT-D-3OH-1与pMD18-T克隆载体相连接,构建得到的重组载体命名为pT-UGT,之后再将其转化到大肠杆菌中JM109中,经过菌液PCR鉴定和双酶切鉴定,初步认定构建成功,进一步测序显示成功构建了重组载体pT-UGT。(3)用BamHI和Sal I两个酶对克隆载体pT-UGT和原核表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)分别进行酶切,使用T4 DNA连接酶将UGT-D-3OH-1基因与原核表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)分别相连接,构建了重组质粒pET-22b-UGT和pET-28a-UGT,通过测序验证了载体上的目的基因序列正确。将两种重组质粒分别转化至E.coli BL21(DE3)中,最终构建了两种原核表达工程菌BL21-UGT-22b和BL21-UGT-28a。(4)对构建成功的两种工程菌分别进行培养,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE检测工程菌中目的蛋白的表达情况,结果表明目的蛋白在两种工程菌中均有表达,都是以不可溶的包涵体形式表达,在工程菌BL21-UGT-22b中表达的目的条带分子量约为50 KDa,比UGT-D-3OH-1的预测分子量少了5 KDa,在工程菌BL21-UGT-28a中表达的目的条带与UGT-D-3OH-1的预测分子量一致,大小为55 KDa。(5)对工程菌BL21-UGT-28a中以包涵体形式表达的目的蛋白进行复性,复性后加入底物进行酶促反应,通过HPLC检测到了反应产物人参皂苷Rh2,含量为6.657×10~(-3) mg/L,说明包涵体复性后具有了正常的酶活,酶活大小为1.78×10~(-4) U/m L。(6)从初始诱导OD600nm值,IPTG浓度,诱导时间,诱导温度四个方面对工程菌BL21-UGT-28a的发酵条件进行了优化,确定了最佳发酵条件为:初始诱导OD600nm值0.8,IPTG浓度0.1 m M,诱导时间6 h,诱导温度37℃,在此条件下目的蛋白的表达量占菌体总蛋白表达量的比例为53.5%。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

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