新疆南部地方品种绵羊毛囊KAP7基因的多克隆抗体制备与真核表达

发布时间：2017-12-22 07:28

  本文关键词：新疆南部地方品种绵羊毛囊KAP7基因的多克隆抗体制备与真核表达　出处：《塔里木大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：和田羊羊毛是制作著名“和田地毯”的优良原料,卡拉库尔羊是羔皮品种羊,羊毛品质的提高有利于支撑地方经济的可持续发展。本研究旨在为新疆南部3个地方品种绵羊平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊毛囊角蛋白关联基因KAP7基因对半粗毛绵羊羊毛的产量与质量的影响提供一些理论支持和方法借鉴。本试验以平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊的皮肤毛囊为试验材料,提取皮肤毛囊总RNA,反转录获得cDNA第一链;(1)用原核引物PCR扩增毛囊角蛋白KAP7基因,构建pMD18-T-KAP7重组克隆质粒,进行双酶切鉴定后构建p ET28a(+)-KAP7原核表达重组质粒,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达,做SDS-PAGE电泳检测,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,加弗氏佐剂免疫家兔得到多克隆抗体血清,使用间接的ELISA检测抗体效价;(2)用荧光定量PCR检测平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊在m RNA水平上毛囊角蛋白KAP7基因表达量的差异;(3)用真核引物PCR扩增毛囊角蛋白KAP7基因,构建pMD18-T-KAP7重组克隆质粒,进行双酶切鉴定后构建pEGFP-N1-KAP7真核表达重组质粒,转染COS-7细胞,检测荧光,并做Western Blot检测。结果表明:(1)毛囊角蛋白KAP7基因原核表达重组质粒pET28a(+)-KAP7可以在BL21大肠杆菌中表达大小约为10 Ku的蛋白;(2)通过实时荧光定量PCR得到毛囊角蛋白KAP7基因在和田羊与卡拉库尔羊之间在mRNA水平上表达量存在差异;(3)成功构建p EGFP-N1-KAP7真核表达重组质粒,可以在COS-7细胞中表达蛋白。结论:(1)毛囊角蛋白KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体的阳性血清具有很高的免疫活性和特异性;(2)通过荧光定量PCR得到毛囊角蛋白KAP7基因在平原型和田羊与山区型和田羊皮肤毛囊mRNA水平上表达量差异不显著(P0.05),而在两个品种的和田羊与卡拉库尔羊皮肤毛囊mRNA水平上表达量差异显著(P0.05);(3)KAP7基因在COS-7细胞中能够表达出大小约为39 Ku的蛋白。
【学位授予单位】：塔里木大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;S826

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本文编号：1318946