MDV编码的去泛素化酶UL36的活性及酶解特异性分析

发布时间：2017-12-22 08:29

  本文关键词：MDV编码的去泛素化酶UL36的活性及酶解特异性分析　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：泛素化调节系统是真核细胞内调节蛋白质功能的最重要的调节系统之一,几乎参与了细胞内所有的生命过程。蛋白质通过泛素化酶与去泛素化酶的催化实现泛素分子(Ub)在蛋白上的修饰与去修饰,从而调节蛋白质的降解和功能上的变化。目前已发现的去泛素化酶可分为六个家族,其中泛素特异蛋白酶类(USP)包含的成员最多。研究发现,很多病毒感染宿主后,能够利用宿主的细胞表达自身编码的去泛素化酶,并通过这些病毒的去泛素化酶干扰宿主细胞的泛素化调节系统,从而控制宿主的免疫调节,促进病毒的复制和传播。MDV编码一种大被膜蛋白(UL36),长约3000多个氨基酸,其N端结构与USP类去泛素化酶相似,推测其具有去泛素化酶活性,MDV可能利用UL36的去泛素化酶活性影响宿主细胞,特别是T淋巴细胞的泛素调节系统,从而促进MDV病毒感染、诱导MD肿瘤发生以及影响宿主的免疫系统。然而,目前还未见有关MDV编码的UL36活性的直接研究报道。本研究克隆了UL36的N端两段DNA序列,应用原核表达系统和昆虫细胞表达系统分别表达纯化了UL36-323-strep、UL36-323-GST蛋白和UL36-480-GST三个蛋白。应用不同类型的Ub类底物和类泛素底物分析了UL36蛋白的去泛素化酶活性和酶解特异性。结果表明,UL36具有去泛素化酶解活性,对K6、K11、K27、K29、K33、K48以及K63型泛素链都具有不同程度的水解活性,其中对K11、K48和K63型泛素链具有完全水解活性;三个UL36蛋白都能水解Ub4、Poly-Ub和Ub-PLA2底物;但对SUMO类底物和罗丹明标记的类泛素NEDD8、FAT10、UAF1、ISG15底物均无水解活性。酶抑制实验发现,高浓度(5×)的Roche公司的Complete Protease Inhibitor Cocktail可部分抑制UL36的活性;Ub特异性的抑制剂Ub-VS可完全抑制UL36活性,这些结果进一步证实UL36具有特异的水解Ub底物的去泛素化酶活性。为进一步确定UL36去泛素化酶活性关键基团,我们经过序列比对分析并根据其他病毒的相关报道,推测MDV编码的UL36蛋白的第98位半胱氨酸和第234位组氨酸及其附近序列在各疱疹病毒中高度保守,并且类似于真核细胞中去泛素化酶的活性中心。为此,我们突变了C98和H234,表达纯化了三个突变体蛋白UL36-480C98A-GST、UL36-480C98S-GST和UL36-480H234A-GST,并对其活性进行了分析。结果发现,三种突变体蛋白的去泛素化酶活性均有不同程度的下降,但并未完全消除。本研究通过两种表达系统表达并纯化出MDV编码的UL36蛋白,确定了UL36具有去泛素化酶活性,对不同泛素底都有水解活性,其中能完全水解K11、K48和K63型Ub链,但不能水解类泛素分子底物。推断的保守活性中心的突变可降低UL36的去泛素化酶活性。本研究这些体外结果为进一步研究UL36细胞内功能,以及探索MDV的致病机制提供了重要的参考数据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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