小分子IWR1维持小鼠上胚层干细胞自我更新的机制探究

发布时间：2017-12-23 16:35

  本文关键词：小分子IWR1维持小鼠上胚层干细胞自我更新的机制探究　出处：《安徽大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：干细胞是一类具有自我更新能力的细胞,在体外培养条件下可无限增殖,同时保持着分化为不同类型细胞和组织的潜能,现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一,具有巨大的应用前景。小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)是第一株在体外成功建立的干细胞系。此后,人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)系也得以成功构建。2007年,科学家们又从小鼠着床后的囊胚上胚层中分离得到一种新型的干细胞——小鼠上胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)。值得关注的是,mEpiSCs与mESCs虽然具有相同的物种属性,但二者在生物学特性上存在较大差异,而mEpiSCs与hESCs之间却表现出许多更为相似的特性。由于人源性,hES C s无法进行嵌合体实验或其它涉及伦理问题的研究,在此种情况下,mEpiSCs则可以充当相应空白领域的补充材料,而对于mEpiSCs的深入研究,也是对整个干细胞研究领域的拓展,有利于扩大人们对于干细胞内部信号调控网络的认识。早期分离得到的mEpiSCs被培养在人工合成培养基(chemically defined medium,CDM)中,并加入细胞因子激活素A(ActivinA)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast grow factors-2,FGF2)来维持细胞的自我更新状态。但此种条件下培养的细胞易出现生长缓慢、不耐受单细胞消化、易凋亡等问题。经改进后的培养条件,以10%胎牛血清(FBS)含量的DMEM培养基为基础,加入Activin A、bFGF、IWR1(Axin蛋白的稳定剂)以及Y27632(ROCK激酶的抑制剂)这四种细胞因子和小分子化合物,可以显著提高mEpiSCs的存活能力。然而,Activin A+bFGF+IWR1+Y27632培养条件由于涉及因子种类过多,不利于后续对细胞内信号通路与调控机制的深入探究,且培养成本较高。我们在前期工作中尝试对mEpiSCs的培养条件作进一步改进与优化,最终得到仅添加IWR1和Y27632即可使mEpiSCs维持在自我更新状态的最佳培养条件。为探究IWR1和Y27632维持mEpiSCs自我更新的作用机制,设计对照实验,检测IWR1条件下和Y27632条件下,mEpiSCs中各基因的差异化表达程度,并以此为基础,筛选出每种小分子可能作用的靶基因。考虑到课题周期的限制,我们首先选取IWR1作为研究对象,筛选出其在细胞中可能作用的下游靶基因为Foxd3,并利用另一种小分子CHIR99021与IWR1对于Wnt/β-catenin信号通路所具有的拮抗作用来设计反向实验,证明了 Foxd3的表达与IWR1之间确实具有相关性。下一步,围绕Foxd3来设计实验,探究IWR1调控mEpiSCs自我更新状态的中间媒介。相关实验分两个方向展开:其一,构建包含目的基因的过表达载体,转染并借此在细胞内上调Foxd3的表达量,观察其能否替代IWR1来维持细胞的自我更新状态;其二,利用shRNA干扰的方法,在mEpiSCs内下调Foxd3的表达水平,观察细胞是否出现分化现象。在mEpiSCs中分别上调与下调Foxd3后,通过形态观察、细胞计数、qRT-PCR、免疫荧光等实验手段来检测mEpiSCs的自我更新水平与生长情况。结果显示,在缺乏IWR1的培养条件下,与对照组细胞相比,过表达Foxd3后的mEpiSCs能够维持正常的形态特征,且生长速率明显提高,qRT-PCR实验可检测到细胞内自我更新标志基因Esrrb、Nanog和Oct4的正常表达,且代表不同胚层的分化基因,如Gata6、Mixl1和Nestin的表达量未出现变化,而在免疫荧光实验中也可检测到自我更新标志基因Oct4和Nanog的蛋白表达产物,说明上调Foxd3的表达量,能够替代IWR1的作用来维持mEpiSCs处于自我更新状态;另一方面,在IWR1存在的条件下,下调Foxd3后的mEpiSCs与对照组相比,细胞形态出现异常,自我更新标志基因Oct4和Nanog在转录与蛋白水平上的表达量均出现下调,且内胚层、中内胚层与中胚层的标志基因表达水平出现显著上升,说明下调Foxd3的表达量,能够使IWR1维持mEpiSCs自我更新的作用失效。由此可以推断Foxd3作为小分子IWR1的下游靶基因,在其调控mEpiSCs生长与内部信号通路的过程中发挥着重要作用,是维持细胞自我更新状态的关键环节。该研究结果扩大了目前人们对于维持mEpiSCs自我更新分子机制的理解,有利于后续对其展开进一步的基础研究与应用,同时可以为探究人胚胎干细胞以及其他种类多能性干细胞的自我更新机制提供线索。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q23

【参考文献】

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1 ;Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes[J];Cell Research;2003年04期

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本文编号：1324636