人骨形态蛋白2在毕赤酵母中的表达和生物活性测定

发布时间：2017-12-24 08:01

  本文关键词：人骨形态蛋白2在毕赤酵母中的表达和生物活性测定　出处：《天津工业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：骨形态发生蛋白2(BMP2)是转化生长因子-β超家族成员中最有效的成骨信号分子之一,已被证明是刺激成骨和软骨再生的较强的骨诱导因子,并且其目前已用于多种骨折的治疗,例如骨缺损,非结合性骨折,脊柱融合,骨质疏松和根管手术等。然而直接从骨头中分离BMPs具有成本高、产量低(1-3 μg/kg)和纯化方案复杂等问题,而且不能很好地保持其生物活性。因此选择基因重组的方式表达BMP2蛋白。为避免大肠杆菌原核表达系统在外源蛋白表达和纯化过程中可能发生的表达率低,包涵体形成,蛋白的不正确折叠和毒性等问题,以巴斯德毕赤酵母真核表达系统作为替代方案,描述了通过体外分泌产生具有生物活性的 rhBMPs。本研究的主要目的是开发一种高产量和简易的rhBMP2生产过程。首先对BMP2蛋白进行结构分析,选取编码其前肽和成熟肽部分的基因作为表达的基因序列,并设计EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点、蛋白纯化标签6×His,成功构建表达质粒PPIC9K-BMP2与pPICZαA-BMP2,线性化表达质粒后分别转进GS115和X33菌株,并筛选高拷贝菌株诱导表达;其次,对发酵产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,利用Ni2+-NTA柱纯化rhBMP2蛋白,并对诱导时间、甲醇浓度、初始菌浓度、培养基pH等条件进行优化,通过Human BMP2 ELISA Kit对rhBMP2进行定量分析,确定最佳表达条件;最后,利用BMP2蛋白对小鼠成肌细胞(C2C12)增殖分化的作用,测定碱性磷酸酶(ALP)活性,MTT法测定细胞的增殖分化能力,进行茜素红染色观察钙沉积情况,并对细胞进行形态学鉴定分析。结果成功筛选出抗3 mg/mLG418的高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-BMP2,其最佳诱导表达条件为初始菌浓度OD600nm=1.0,甲醇浓度1.0%,诱导培养基pH6.0,诱导72 h,且rhBMP2最高表达量为189.6μg/L,蛋白浓度为10 μg/mL时表现出良好的生物活性,ALP活性最大为40.4 U/L。
【学位授予单位】：天津工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q51

【参考文献】

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本文编号：1327506