粘细菌中利用CRISPR-dcas9系统抑制基因表达

发布时间：2017-12-24 20:16

本文关键词：粘细菌中利用CRISPR-dcas9系统抑制基因表达　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：粘细菌是原核生物中具有最复杂社会运动的一类细菌,具有复杂的细胞行为、多种信号调控途径、能产生大量活性次级代谢产物,但其代时长、培养及遗传操作困难,其基因功能和化合物的生产没能有效地探究和开发。CRISPR-cas9是微生物的一种的免疫系统,经过不断地发展,将其改造成了一种新型基因编辑工具。将Cas9蛋白的核酸酶位点突变(变为dead cas9简称dcas9)以后,CRISPR-dcas9不能切割靶基因,但能抑制该基因的表达,进而发展成一种新的基因调控工具。当在dCas9蛋白上融合不同的效应元件时能实现不同的目的,如融合RNA聚合酶的ω亚基,使其在靶基因启动子上游招募RNA聚合酶,实现靶基因的转录激活。CRISPR-cas9/dcas9具有无物种限制,基因调控方式多样,基因修饰率高,可实现多基因同时调控操作简单等优点。因此,在粘细菌中引入该系统进行基因功能的探究。论文选用的CRISPR-cas9系统来源于酿脓链球菌,cas9基因的GC含量仅为31%,而黄色粘球菌DK1622基因组的平均GC含量为67%,cs9基因在黄色粘球菌中对应的转运RNA出现频率较低。cas9基因经过密码子优化后(称为mxcas9),GC含量提高到61%,密码子对应的转运RNA出现频率达到最大。mxcas9基因通过Red/et技术将核酸酶位点突变,再利用整合质粒将其插入到细菌基因组。sgRNA利用PZJY41质粒表达,该质粒由PMF1质粒改造而来。利用构建的CRISPR-dcas9系统抑制piLA和difA基因时,抑制菌株与野生型菌株表型有显著差异。抑制0049基因时,抑制菌株和野生菌株之间不形成界限。在粘细菌中构建好的CRISPR-dcas9能在一定程度上抑制靶基因的表达,但不能完全沉默基因。为提高CRISPR-dcas9系统的抑制效率,需对CRISPR-dcas9系统进行优化。提高CRISPR-dcas9系统对靶基因的抑制效率,首先提高sgRNA和dcas9在细胞中的浓度,将它们的启动子都改为强启动子(sgRNA用的是强启动子pili,仅需更换dcas9启动子)。更换启动子后利用该系统抑制pilA基因,pilp基因的表达量并没有明显的下降。之后,利用sgRNA靶向同一基因的不同部位,发现越靠近基因末端,抑制效率越低。总体而言,在粘细菌中构建的CRISPR-dcas9系统能使靶基因的表达量下降约2/3。丙酰辅酶A和甲基丙二酸单酰辅酶A分别是埃博霉素A和埃博霉素B的底物,它们在细胞中的浓度维持较低水平,利用CRISPR-dcas9系统抑制它们的其他支路以提高埃博霉素的产量。丙酰辅酶A是脂肪酸合成的重要底物,利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的翻译起始位点后,与对照菌株相比,埃博霉素A的产量有一定的提高,但埃博霉素总产量却降低了,原因是菌株的生长受到了明显影响。利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的ORF末端,埃博霉素A产量明显提高,与埃博霉素B产量几乎相同(ZE9菌株中埃博霉素A:埃博霉素B≈1:3)。甲基丙二酸单酰辅酶A可以被甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶和甲基丙酰辅酶A羧基转移酶转变为其他物质,抑制甲基丙二酸单酰辅酶A,埃博霉素产量下降;抑制甲基丙酰辅酶A羧基转移酶,埃博霉素产量有一定提高。dcas9蛋白融合RNA聚合酶的ω或α亚基后能激活靶基因的转录,利用系统激活埃博霉素基因簇时,前者能提高埃博霉素产量,后者反而使埃博霉素总产量降低。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【相似文献】