FOXQ1过表达对人脐带间充质干细胞的抗衰老作用及其机制探究

发布时间：2017-12-26 08:13

本文关键词：FOXQ1过表达对人脐带间充质干细胞的抗衰老作用及其机制探究　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：干细胞是一类具有自我更新能力与多向分化潜能的重要细胞群体。并且,在阿尔茨海默症、帕金森症等研究领域干细胞转化医学的研究已经取得了丰硕的成果。其中,脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)具有取材方便,低免疫原性,分化能力强等等优势,成为转化医学研究的重要实验对象。但是,hUC-MSCs在体外培养条件下,随着操作中不可避免的机械损伤、化学处理,使得细胞增殖分化能力也随之减弱,最为重要的是干细胞的干性也随之降低,这成为严重限制hUC-MSCs临床实验应用的关键点。FOXQ1是叉头框蛋白家族(Forkhead box Family,FOX)中一种重要的转录调控因子。近年的肿瘤学研究发现在多种肿瘤组织中,FOXQ1均呈高表达,且其表达量与病患的肿瘤恶性程度呈现正相关。同时,在众多肿瘤细胞系中,FOXQ1可以调控癌细胞增殖、周期、迁移等过程,进而调控肿瘤的发生与转移。体外实验证明,通过过表达或敲除FOXQ1,肿瘤细胞的增殖能力也随之增强或减弱。以上结果提示,FOXQ1在肿瘤增殖、转移中的具有重要意义,可能成为未来肿瘤学研究中的基因靶点。鉴于FOXQ1的生物学功能,研究其能否延缓hUC-MSCs的衰老,促进增殖,能否引起细胞癌变成为实验研究的重点,同时,相对众多肿瘤学研究,此项研究亦是FOXQ1首次在正常体细胞中研究,而且,hUC-MSCs中FOXQ1的作用机制尚不明确,需要深入的实验探究。目的通过慢病毒介导,过表达FOXQ1基因后,在衰老的hUC-MSCs中,探究体外体内条件下,过表达FOXQ1是否会对hUC-MSCs产生促进增殖、延缓衰老的作用,以及研究FOXQ1在hUC-MSCs中的内在调控机制。方法1、构建FOXQ1过表达的慢病毒载体并在hUC-MSCs中验证过表达效果首先,分离脐带细胞并进行表面抗原鉴定。之后,通过PCR扩增FOXQ1的CDS序列,将其插入慢病毒载体EcoR I与Xba I酶切位点之间,包装提取纯化病毒液。感染hUC-MSCs并通过药筛建立稳定细胞系。通过western blot与qPCR检测过表达组与空载对照组的FOXQ1表达量差异。2、体外实验研究FOXQ1过表达对hUC-MSCs增殖、衰老等相关指标的影响及其机制探究首先,检测不同代数的hUC-MSCs衰老程度与FOXQ1的蛋白表达量。其次,具体细胞分组分为P3-hUC-MSCs,P15-hUC-MSCs,P15-Vector-hUC-MSCs(病毒空载对照组),P15-FOXQ1-hUC-MSCs(病毒过表达组)。通过CCK-8检测细胞增殖,SA-β-gal检测细胞衰老。western blot与qPCR检测衰老相关基因(P16、P21、P53、SIRT1、PCNA)表达,流式细胞术检测细胞周期变化。荧光法鉴定细胞凋亡情况。Transwell小室检测细胞迁移能力变化。最后,qPCR检测不同组间加入SIRT1抑制剂EX527前后的衰老相关分泌表型(SASP,senescence associated secretory phenotype)水平变化(主要是IL-6、IL-8)。3、体内实验通过检测FOXQ1过表达后的hUC-MSCs对APP+鼠的治疗效果,反映过表达后hUC-MSCs在体内条件下的存活与增殖能力的变化首先,体内实验分组,共计6组,分别是WT组(C57BL/6鼠,非治疗对照组),APP+(非治疗对照组),P3(P3代干细胞治疗组),P15(P15代干细胞治疗组),P15-Vector(P15代病毒空载干细胞治疗组),P15-FOXQ1(P15代过表达FOXQ1干细胞治疗组)。PCR鉴定APP+和WT鼠。取五月龄SPF级小鼠,每组10只,共计60只。经过一个月干细胞注射治疗后,通过莫氏水迷宫检测小鼠学习记忆能力的变化。处死小鼠后,取血清检测SOD含量。取全脑,免疫组化检测小鼠海马MAB1281表达情况。提取海马蛋白,检测衰老相关基因P16、P21、P53、SIRT1、SIRT2、PCNA,以及AD致病相关蛋白tau、p-tau(ser396),p-tau(ser235)的表达变化。结果1、流式细胞术结果显示,符合hUC-MSCs表面抗原表达情况,不表达CD29(99.8%),CD90(99.5%),HLA-ABC(99.6%);高表达CD34(99.2%),CD45(99.9%),HLA-DR(99.6%)。FOXQ1过表达慢病毒重组载体构建成功,FOXQ1过表达组hUC-MSCs的FOXQ1蛋白及mRNA表达水平较病毒空载组有极显著升高(P0.01)。2、通过western blot与SA-β-gal检测结果发现,随着干细胞的衰老,FOXQ1的表达也随之下降。CCK-8结果显示,FOXQ1过表达组较空载组细胞增殖能力有显著增强(P0.05),SA-β-gal染色结果提示,过表达组的蓝染率较空载组明显下降(P0.01)。蛋白水平检测结果显示,过表达组的衰老正相关蛋白p16(P0.01)、p21(P0.05)、p53(P0.05)表达均低于空载组,衰老负相关蛋白SIRT1(P0.01)、PCNA(P0.05)均明显高于对照组。mRNA表达水平上P16(P0.05)、P21(P0.01)、P53(P0.05),SIRT1(P0.05)、PCNA(P0.05)的表达呈现出相同趋势。FOXQ1过表达后,hUC-MSCs其增殖能力增强,但细胞仍会随着代数增加而衰老,细胞分裂能力增强,并未达到无限增殖能力,传代过程中未出现癌细胞形态学变化。在细胞迁移能力方面,FOXQ1过表达可以显著促进细胞迁移能力。通过荧光法分析,FOXQ1可以显著减少细胞凋亡。在SASP探究中,FOXQ1过表达组较空载组,其IL-6(P0.01),IL-8(P0.05)表达水平明显较低。当FOXQ1过表达组加入SIRT1抑制剂EX527后,其SASP表达水平上升,接近至空载组水平(P0.05)。3、各组小鼠水迷宫实验结果显示,FOXQ1过表达治疗组的小鼠学习记忆能力有着显著提升,其逃避潜伏期,穿越平台次数,平台象限停留时间均有明显高于对照组(P0.05)。小鼠海马MAB1281免疫组化染色结果显示,FOXQ1过表达组的海马区域细胞迁移率较对照组有显著提升(P0.05),血清SOD含量明显升高(P0.05)。小鼠海马部分western blot检测结果显示,衰老正相关蛋白P21、P53,过表达组明显低于对照组(P0.05),P16差异不显著。衰老负相关蛋白SIRT1、SIRT2、PCNA,过表达组明显高于对照组(P0.05)。AD致病相关蛋白,tau蛋白差异不显著,对于磷酸化tau蛋白水平p-tau(ser396),p-tau(ser235)(P0.05),FOXQ1过表达组表达水平明显低于对照组水平。结论1、脐带分离的细胞符合hUC-MSCs表面抗原表达。FOXQ1慢病毒过表达载体系统可以有效提高其在hUC-MSCs中的表达,蛋白水平及mRNA水平均有显著提高。2、FOXQ1过表达后,使hUC-MSCs在体外增殖能力,迁移能力,抗衰能力明显增强,未出现癌细胞特征;FOXQ1可通过SIRT1调节细胞衰老相关分泌表型,进而调控细胞衰老进程。3、体内条件下,FOXQ1过表达促进了hUC-MSCs在小鼠脑内的的存活能力与迁移能力。亦间接说明,FOXQ1过表达增强了hUC-MSCs抗衰能力。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R329.2

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