TBC1D15基因的敲除细胞系构建及其功能研究

发布时间：2017-12-28 19:05

  本文关键词：TBC1D15基因的敲除细胞系构建及其功能研究　出处：《浙江理工大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： CRISPR-Cas9 TBC1D15 2-NBDG 糖吸收

【摘要】：在胰岛素调控条件下,GLUT4协助葡萄糖从细胞外顺浓度梯度,在囊泡的参与下进入细胞。Rab蛋白(Ras超家族的成员)参与这一重要生理过程,而TBC家族蛋白质参与Rab的GTPase活性调节。因此,通过研究TBC蛋白质有助于深入研究血糖调节作用的分子机制,从而发现治疗血糖代谢相关疾病(例如:2型糖尿病)的新的药物靶点。目前TBC蛋白质家族成员TBC1D1、TBC1D4、TBC1D13已被证实参与GLUT4囊泡转运过程,调节胰岛素信号途径,但未见TBC1D15参与该过程的相关报道。先前研究表明,从条纹斑竹鲨中发现的天然活性肽是TBC1D15的N端的一部分序列,天然的鲨肝肽(Active peptide from shark liver,APSL)能够保护受损肝脏,改善并修复胰岛β细胞损害。基因序列比对结果表明:条纹斑竹鲨TBC1D15与人TBC1D15相似性为67%,TBC域相似性高达91%,具有高度同源性;因此,我们推测TBC1D15很可能参与胰岛素信号途径,调节血糖代谢过程。利用CRISPR-Cas9系统敲除HeLa细胞中的TBC1D15基因,从细胞水平上研究TBC1D15是否与糖代谢相关。本研究基于CRISPR-Cas9系统开展构建基因敲除细胞系的构建。首先针对TBC1D15的外显子进行gRNA设计,运用Cas9(D10A)蛋白通过配合一对gRNA分别靶定到靶定位点的DNA互补链中,从而形成功能性的双链断裂,产生双切口的原理(降低脱靶效应)设计并获得7对gRNA序列,随后将这7对gRNA序列分别构建至pX462(含嘌呤霉素抗性基因)载体中,通过测序及比对验证,成功构建了7对含gRNA的重组质粒。MTT实验获得HeLa细胞的嘌呤霉素筛选浓度为1μg/mL。随后,将每对质粒分别转染He La细胞,转染24h后,换成含嘌呤霉素的培养基筛选细胞株,待阴性对照即正常He La细胞全部死亡后,用有限稀释法挑选出单克隆细胞株,随后进行扩大培养并进行验证实验。通过形态学观察获得一株形态异常的单克隆细胞株,且生长速度较正常HeLa细胞慢,随后利用Western Blotting、qRT-PCR、基因组PCR分别验证TBC1D15的表达、转录和基因组水平的变化。Western Blotting未检测到该细胞株TBC1D15的明显表达,qRT-PCR表明其mRNA转录水平上降低90%,基因组PCR显示该细胞株TBC1D15有大片段的删除。这些结果表明该株细胞为一株TBC1D15基因敲除的细胞株。通过2-NBDG葡萄糖荧光类似物培养后,经流式细胞仪检测,证实:在细胞水平上,所得到的TBC1D15基因敲除细胞株糖吸收降低,提示TBC1D15在糖吸收中发挥重要作用。
[Abstract]:Under the regulation of insulin, GLUT4 assists glucose from the extracellular concentration gradient and enters the cell with the involvement of vesicles. Rab proteins (members of the Ras superfamily) are involved in this important physiological process, and TBC family proteins are involved in the regulation of GTPase activity of Rab. Therefore, the study of TBC protein is helpful to further study the molecular mechanism of glycemic regulation, and find a new drug target for the treatment of glycemic related diseases (such as type 2 diabetes). At present, TBC protein family members TBC1D1, TBC1D4 and TBC1D13 have been proved to be involved in GLUT4 vesicle transport process, regulating insulin signaling pathway, but no TBC1D15 has been involved in this process. The previous studies show that bioactive peptides from c.plagiosum is TBC1D15 in the N terminal part of the sequence of shahepatide (Active peptide from shark natural liver, APSL) can protect damaged liver, improve and repair the islet beta cell damage. Gene sequence alignment results showed that chiloscylliumplagiosum TBC1D15 and TBC1D15 67% similarity to the TBC domain, the similarity of up to 91%, with a high degree of homology; therefore, we hypothesized that TBC1D15 might be involved in insulin signaling pathways that regulate glucose metabolism process. The CRISPR-Cas9 system was used to knock off the TBC1D15 gene in HeLa cells and to study whether TBC1D15 was associated with glucose metabolism at the cell level. In this study, the construction of gene knockout cell lines was constructed based on the CRISPR-Cas9 system. According to the TBC1D15 exons of gRNA design, the use of Cas9 (D10A) protein with a pair of gRNA were targeted to the target sites of the DNA complementary chain, thus forming a double strand breaks of the principle of double incision (to reduce the Miss effect and get 7) design of gRNA sequence, then the 7 gRNA sequences were constructed to pX462 (containing the puromycin resistance gene) vector, by sequencing and comparison and verification, successfully constructed the recombinant plasmid containing gRNA to 7. The concentration of purinomycin in HeLa cells was 1 micron g/mL from the MTT test. Then, each of the plasmids were transfected into He La cells after 24h transfection into cultured in puromycin containing medium screening cells to normal cells in negative control He La died after using limited dilution method selected monoclonal cell lines were subsequently expanded in culture and experimental verification. A morphologically abnormal monoclonal cell line was obtained through morphological observation, and its growth rate was slower than that of normal HeLa cells. Subsequently, Western Blotting, qRT-PCR and genomic PCR were used to verify the expression, transcription and genomic level of TBC1D15. Western Blotting did not detect the expression of TBC1D15 in the cell line. QRT-PCR showed that the transcriptional level of mRNA decreased by 90%. Genomic PCR showed that TBC1D15 deleted from the cell line. These results suggest that the cell is a cell strain of TBC1D15 gene knockout. After 2-NBDG glucose fluorescence analogue was cultured, it was confirmed by flow cytometry. At the cell level, the glucose absorption of TBC1D15 knockout cell lines decreased, suggesting that TBC1D15 plays an important role in sugar absorption.
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：1347031