高产红曲色素低产桔霉素的福建红曲菌种构建

发布时间：2017-12-29 23:03

  本文关键词：高产红曲色素低产桔霉素的福建红曲菌种构建　出处：《福建师范大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 红曲 色素 桔霉素 过表达 敲除

【摘要】：红曲菌(Monascus)我国重要的微生物资源,可以产生红曲色素、莫纳可林K、Y-氨基丁酸、麦角固醇等多种次生代谢产物。然而随着具有肾毒性、致畸性以及致癌性桔霉素的发现,对我国红曲产品的生产、出口等造成巨大冲击。因此,获得高产色素而低产甚至不产桔霉素红曲菌株的任务迫在眉睫。本研究通过对福建红曲霉M-CL培养基成分及培养条件进行探究。研究内容包括碳源、氮源、接种量、发酵温度、发酵时间、装液量、转速等方面,研究结果表明该红曲菌的最优碳源为大米粉,氮源为蛋白胨,培养条件为接种量10%,装液量50ml/250ml,转速180r/min,发酵温度30℃,发酵时间6天。以福建红曲霉M-CL为出发菌株,通过重叠延伸PCR技术融合PtrpC启动子基因、MpigE基因、TrpC终止子基因,通过双酶切与连接技术连接融合片段与带有潮霉素抗性的PSKH质粒,从而构建红曲菌过表达载体HPMT。经过测序及双酶切验证证实过表达载体构建成功。采用原生质体PEG介导转化法进行转化,并对红曲菌原生质体的制备条件进行优化,当裂解酶的组合为：0.4%溶菌酶、0.6%蜗牛酶、0.8%纤维素酶,渗透压稳定剂为0.6mol/L MgSO4,酶解温度为30℃,酶解时间为3h时其原生质体的数目达到最大值。成功转化出发菌株红曲霉M-CL后,利用浓度为100μg/ml潮霉素筛选突变菌株。液态发酵原始菌株及突变菌株,通过高效液相色谱法测定桔霉素含量,采用紫外分光光度法测色素含量。结果表明过表达菌株较原始菌株桔霉素产量降低了41.8%,而色素产量提高了11%。为了进一步降低红曲中桔霉素的含量,本实验通过重叠延伸PCR的方法成功构建了两端含敲除片段同源臂序列中间为潮霉素抗性基因的敲除组件,通过序列分析,表明我们已经成功构建了红曲菌敲除组件,进一步将转化过表达菌株中,为获得更优的菌种奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93

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本文编号：1352238