桃柁酚抗金黄色葡萄球菌的活性及机制研究

发布时间：2018-01-05 07:29

  本文关键词：桃柁酚抗金黄色葡萄球菌的活性及机制研究　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：据报道,食源性致病菌如金葡菌(金葡菌)引起的食品污染对人类的身体健康造成了严重的威胁。金葡菌能够引起食源性疾病和食物中毒,这与社会公共健康密切相关,并且这一领域在近年来受到越来越多的关注。此外,金葡菌还能够引起一系列的感染,这也是全球主要关心的问题。金葡菌产生多种毒力蛋白,进而导致感染和食物中毒。这些毒性蛋白包括透明质酸酶,蛋白酶,凝固酶,脂酶,脱氧核糖核酸酶以及肠毒素等。在这些由金葡菌产生的毒力蛋白中,外毒素α-溶血素,葡萄球菌肠毒素A(SEA)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)在一定意义上被认为是导致致病性的主要原因。桃柁酚,一种从罗汉松中提取出来的传统的中草药,是一种新颖的抗菌酚二萜,有报道发现桃柁酚能够有效地抑制一些病原体的扩散。然而,并没有报告指出桃柁酚对金葡菌产生的α-溶血素,SEA和SEB分泌的影响,且桃柁酚抗金葡菌的抗菌机制也尚未清楚。因此,在这项研究中,我们的第一个目的就是评估桃柁酚这三个外毒素分泌的影响,另外,桃柁酚对金葡菌的抗菌活性和抗菌机制-膜破损机制也被探究出来。桃柁酚能够在低剂量的条件下抑制金葡菌的生长繁殖,并且可以抑制的外毒素的分泌产生。此外,桃柁酚通过破坏细菌的细胞膜的作用方式进行抗菌,破坏菌体细胞膜,导致细胞死亡。桃柁酚对金葡菌的MIC值已经通过实验确定,我们得出的结论是,桃柁酚对对金葡菌菌株的MIC值为2 4μg/m L。而对于金葡菌标准株ATCC 29213,桃柁酚对其MIC值是2μg/m L。时间-杀菌曲线的实验测定结果表明,桃柁酚能够在实验室条件下和食品模型中抑制金葡菌的生长,且呈现剂量依赖性。在每个时间点,在0.25μg/m L的桃柁酚浓度下,金葡菌的菌落数并没有明显减少,然后在0.5μg/m L的桃柁酚浓度下金葡菌的菌落数开始明显减少,在1μg/m L的桃柁酚浓度下金葡菌的菌落数开始最大幅度的减少。在溶血试验中,与空白对照组相比较,当加入终浓度为0.25、0.5和1μg/m L的桃柁酚时,溶血的比例分别降低至95.6%,81.5%和26.5%。桃柁酚抑制金葡菌菌上清的溶血能力呈现出明显的剂量依赖性。蛋白免疫印迹实验western blot的结果表明亚抑菌浓度下的桃柁酚能够有效地抑制外毒素α-溶血素,SEA和SEB的分泌,并呈现剂量依赖性的方式。如我们预期一样,桃柁酚也能够显著降低金葡菌ATCC 29213外毒素基因Sar A,agr A,hla,sea和seb的转录水平,也呈现出剂量依赖性。此外,随着亚抑菌浓度下桃柁酚对金葡菌菌悬液的剂量不断增加,RAW 264.7细胞中TNF-α释放的水平也逐渐减少。菌体细胞内胞质内容的泄漏是一个典型的证据能够表明细菌细胞质膜已经受到破坏。因此,电导率测定实验的数据结果表明,桃柁酚处理金葡菌菌悬液之后,上清液的电导率有了不同程度的增加,进而说明,不同浓度的桃柁酚对金葡菌菌体细胞膜产生了破坏作用,严重的影响了都细菌细胞膜的完整性。此外,我们发现桃桃柁酚能够减少金葡菌细胞质中β-半乳糖苷酶的产生。而SDS-PAGE实验和琼脂糖凝胶电泳实验的结果分析表明,桃柁酚能够对金葡菌菌体细胞质膜造成不可逆的损害,并通过渗透和破坏细胞膜,使得菌体内的细胞可溶性蛋白质和核酸减少,最终导致细胞死亡。当金葡菌菌体遇到合适的抗菌剂的时候,金葡菌细胞壁表面恶化,金葡菌菌体的生理变化和形态也随之发生变化。SEM实验观察表明当桃柁酚作用于细菌细胞时,在不同的作用时间,细胞变得畸形,产生褶皱,凹凸不平,甚至有些细胞肿胀,从而引起营养物质和遗传物质的浸出。经TEM分析实验结果表明,桃柁酚造成金葡菌细胞结构的重大损害包括细胞膜和细胞质,这也最终导致了细菌细胞快速溶解和死亡。从这些实验数据中可得出结论,我们的实验结果不仅提供了额外的证据支持桃柁酚是一种天然的抗菌剂,清楚了桃柁酚抗金葡菌的抑菌机制。因此,我们建议桃柁酚可能作为一种很有前途的天然化合物应用于在食品工业和制药工业。
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本文编号：1382156