家蚕肉碱棕榈酰基转移酶BmCPT1基因的鉴定及功能研究

发布时间：2018-01-05 11:35

本文关键词：家蚕肉碱棕榈酰基转移酶BmCPT1基因的鉴定及功能研究　出处：《西南大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肉碱酰基转移酶家族(carnitine acyltransferase family)是指生物体内存在的能和肉碱结合的一类酶的总称,这个家族基因的蛋白质序列上有一个相似的酶活催化结构域,因此将他们归为一个家族。此家族包括乙酰基转移酶(carnitine acetyltransferase,CAT)、肉碱辛酰基转移酶(carnitine oetanoyltransferse,COT)和肉碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferse,CPT),其中CPT又分为肉碱棕榈酰基转移酶1(carnitine palmitoyltransferse 1,CPT1)和肉碱棕榈酰基转移酶2(carnitine palmitoyltransferse 2,CPT2),各主要分布在内质网、过氧化物酶体和线粒体内,不同的酶选择性的催化不同碳链长度的底物。本文基于已测序的家蚕基因组和蛋白质组数据库,以家蚕肉碱酰基转移酶家族中长链脂肪酸分解关键酶BmCPT1基因作为研究对象,对BmCPT1基因进行鉴定、克隆、时空表达分析和功能的研究,探索其在家蚕体内脂肪酸代谢过程中的特点。主要研究结果如下:1、BmCPT1基因的鉴定及序列特征基于家蚕基因组和蛋白质组数据库,以已报道的黑腹果蝇CPT1基因的氨基酸序列为问询序列,进行PSI-BLAST(E0.01)同源性检索得到家蚕BmCPT1基因。获得1个BmCPT1基因,此基因定位于家蚕CHr.1号性染色体的nscaf 3068上,含有肉碱棕榈酰基转移酶特征的两段跨膜区域和位于C端的活性催化结构域。ORF框长2337bp,编码778个氨基酸,具有信号肽序列,没有发现可变剪接体。构建不同昆虫物种内同源CPT1基因的序列对比和系统发生进化树,发现昆虫CPT1基因高度保守。2、BmCPT1基因的表达特征利用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术,分析BmCPT1基因表达模式。BmCPT1基因在大造幼虫期及五龄三天不同组织的表达结果表明,Bm CPT1基因在幼虫期三龄起、四龄起,五龄均表达较高。在大造五龄三天各组织的表达谱中,BmCPT1基因在血液中表达较高,且在不同品种011c、012c、菁松、871和871c间表达谱相似。推断家幼虫在发育变态时和5龄大蚕时期通过脂肪酸分解代谢功能需求较高。3、不同组织的BmCPT1酶活及基因的亚细胞定位取大造五龄三天不同组织,测定Bm CPT1酶活,发现酶活性在头部最高,丝腺组织最低。酶活性由大到小分别是:头表皮气管肌肉卵巢马氏管精巢中肠脂肪体血液丝腺。这一结果与5龄3天不同组织的能量需求是符合的。亚克隆并表达BmCPT1基因,超纯重组质粒转染细胞,细胞核染料DAPI和线粒体染料Mitotracker染色后,共聚焦显微镜观察,结果将BmCPT1基因定位在线粒体。4、BmCPT1基因在不同生长发育时期及感染细菌后的表达胚胎时期BmCPT1基因在卵的胚胎发育中表达量不高,但蚁蚕孵化时表达最高;上簇期间至化蛹3天BmCPT1基因表达呈现较低的水平,且雄性比雌性蚕内的BmCPT1基因表达量略高;而化蛹4天后BmCPT1基因表达突然升高,且雌蛹比雄蛹内的BmCPT1基因表达量显著高;雌蛾在羽化后前三天BmCPT1基因表达量比雄性显著高,羽化三天后开始降低但雌蛾仍高于雄蛾,而雄蛾在羽化后五天之内表达量无显著变化;未交配雄和雌蛾BmCPT1基因表达没有显著变化,但雄蛾BmCPT1基因表达显著低于雌蛾;雌、雄蛾交配后雌蛾的BmCPT1基因表达下降极显著,甚至低于雄蛾。综上所述,BmCPT1基因功能在蛹期雌造卵和成虫产卵过程中均具有重要作用。对大造、871不同家蚕5龄幼虫起蚕注射不同病源物大肠杆菌E.coli和黑胸败血芽胞杆菌Bb,感病状况下检测BmCPT1基因的表达。均发现注射组3h时,雌、雄性蚕BmCPT1基因表达比对照显著降低,6h时,在大造和871内注射E.coli雄雄蚕和注射Bb雌蚕变化趋势一致。综上所述,病菌感染可能引起对脂肪酸氧化供能的利用改变。5、幼虫和蛹期干涉BmCPT1基因体外注射dsRNA,分子水平检测均发现基因表达显著降低。但注射4龄起蚕时处理组比对照延迟进入眠期4-8小时,注射蛹期没发现生物学意义上的显著变化,仅仅有分子生物学的表达变化。综上所述,家蚕BmCPT1基因的表达受发育时期,感染细菌状态,雌雄性别的影响而呈现差异,一定意义上反应了不同阶段、不同性别在利用脂肪酸能量上的不同,简言之,幼虫4龄眠起、五龄眠起、蛹期、蛾期BmCPT1基因表达变化差异明显,幼虫期雄高于雌,而蛹期、蛾期雌高于雄,可能体现了这些时期雌雄性别对脂肪酸能量利用上的不同。这些结果为进一步研究BmCPT1基因的功能奠定了基础。
[Abstract]:In this paper , we studied the characteristics of the gene of Bombyx mori ' s silkworm genome and proteome . The results are as follows : 1 . Identification and sequence characteristics of the gene of Bombyx mori . The main results are as follows : 1 . The gene of Bombyx mori ' s genome and proteome is used as the research object . The results showed that the expression of Bm CPT1 gene was higher than that of male moths . In conclusion , the expression of the gene is different in the stage of development , the status of infected bacteria and the sex of female and male . In conclusion , the difference of the expression of the male and female sex in the larval stage is obviously higher than that of the female , and the pupal stage and the moth stage are higher than that of the male , which may reflect the difference of the sex of the female and the male in the stage of the larva stage . These results provide the foundation for further research on the function of the gene .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55;Q78

【参考文献】