多酚氧化酶的固定化及其对酚类化合物催化氧化性能研究

发布时间：2018-03-03 03:00

  本文选题：壳聚糖/蒙脱土插层复合物　切入点：多酚氧化酶　出处：《中国海洋大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)是一类高效的酚类化合物氧化酶,在有氧条件下能催化单酚类化合物羟基化生成邻苯二酚,又能氧化邻苯二酚脱氢生成醌,最终醌类化合物自聚成不溶于水的高分子聚合物沉淀而被除去。壳聚糖是常用的酶固定化载体,其分子链上存在着大量的羟基、氨基,能够与酶实现有效结合。纳米金粒子具有优异的吸附性能、催化活性和生物相容性,已被成功地应用于酶的传感器的构建,提高酶分子的催化性能。蒙脱土是一种层状硅酸盐,其片层厚度及层间距处于纳米尺度,比表面积大,具有很好的物理吸附性能。本文采用溶液插层法制备了壳聚糖／蒙脱土插层复合物(chitosan/montmorillonite intercalation composites, CTS/MMT)和壳聚糖-纳米金／蒙脱土插层复合物(chitosan-nanogold/montmorillonite intercalation composites, CTS-Au/MMT),并对其结构进行了表征。分别以壳聚糖／蒙脱土和壳聚糖-纳米金／蒙脱土插层复合物为载体,采用吸附法和戊二醛交联法固定多酚氧化酶,考察了固定化多酚氧化酶的最佳制备条件、多酚氧化酶的固定化方法以及固定化酶的性质。选择性能较优的固定化酶对溶液中的苯酚、4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚进行催化氧化,考察了固定化酶对三种酚类化合物催化氧化的最佳条件,探讨固定化酶对三种酚类化合物的动力学性质和重复使用性能,为酚类废水的处理提供应用依据。主要研究内容和结论如下：(1)采用溶液插层法制备壳聚糖／蒙脱土插层复合物,采用红外光谱和X-射线衍射分析对其结构进行表征。并以此为载体,分别运用吸附和戊二醛交联两种法固定多酚氧化酶,考察了戊二醛浓度、溶液pH值、酶与载体质量比和固定化时间对固定化酶活性和载酶量的影响,并以左旋多巴为底物考察了游离酶和固定化酶的性质。实验结果表明,吸附法固定化多酚氧化酶(A-PPO)的活性更高,最佳制备条件为pH 5.0,酶与载体质量比20 mg/g,固定化时间6 h；固定化酶的载酶量为12.12 mg/g,单位载体酶活为12.76×103U/g,酶活回收率达81.7%。A-PPO和交联法固定化多酚氧化酶(C-PPO)的最适酶促反应条件为pH值8.0,温度分别为40℃和30℃。与游离多酚氧化酶相比,固定化酶的操作稳定性、贮存稳定性均有所提高。固定化酶重复使用5次后,可保留37.6%以上的相对酶活。PPO, A-PPO和C-PPO的米氏常数Km值分别为0.48,0.56和2.11mmol/L,较游离酶的Km值均有所增加；最大反应速率Vmax分别为2.70,2.08和2.48 U/g,较游离酶的Vmax值均有所减小。(2)以壳聚糖/蒙脱土插层复合物为载体,吸附法固定化多酚氧化酶,研究了固定化酶对苯酚、4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚的催化氧化性能。结果表明,固定化酶对三种酚类化合物的最佳去除条件分别为：苯酚溶液pH值为7.0,温度30℃；4-氯苯酚溶液pH值为5.0,温度20℃；2,4-二氯苯酚溶液pH值为5.0,温度30℃。固定化酶催化三种酚类化合物的动力学参数表明,固定化酶对2,4-二氯苯酚的亲和力最大,催化反应速度最快,Vmax/Km比值表明2,4-二氯苯酚为固定化多酚氧化酶的最适底物。固定化多酚氧化酶循环使用6次(24 h)后,对三种酚类化合物的去除率分别为15.7%、24.2%和27.8%。(3)以壳聚糖/蒙脱土插层复合物为还原剂,与氯金酸溶液反应制备壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物,探讨了该复合物的最佳制备条件,并对其结构进行表征。以此为载体,分别采用吸附和戊二醛交联法固定化多酚氧化酶,考察了固定化酶的最佳制备条件及其酶学性质。结果表明,壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物的最佳制备条件为氯金酸溶液浓度0.05 mmol/L,氯金酸溶液pH为9.0,反应时间4 h,反应温度80℃。以CTS-Au/MMT为载体,最佳制备条件下吸附法固定化酶(A'-PPO)的酶活为24.02×103U/g,载酶量为17.02 mg/g,与以CTS/MMT为载体相比,CTS-Au/MMT固定化多酚氧化酶的酶活和载酶量明显提高。(4)以壳聚糖-纳米金/蒙脱土插层复合物为载体,吸附法固定化多酚氧化酶,对苯酚、4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚进行催化氧化。结果表明,固定化酶对三种酚类化合物的最佳去除条件为苯酚溶液pH 7.0,温度30℃；4-氯苯酚溶液pH 5.0,温度20℃；2,4-二氯苯酚溶液pH值为5.0,温度30℃。动力学参数表明固定化酶对苯酚的亲和力最大,对4-氯苯酚的催化速度最快。三种底物的Vmax/Km比值4-氯苯酚最大,表明4-氯苯酚为该固定化多酚氧化酶的最适底物。与以CTS/MMT复合物为载体相比,CTS-Au/MMT复合物中作为电子介体的纳米金粒子表现出了较好的吸附活性和催化能力,以此为载体吸附法固定化酶对三种酚类化合物表现出了更好的催化氧化效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q814.2;X703

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本文编号：1559227