猪传染性胃肠炎病毒N基因的荧光定量PCR检测方法建立及初步应用

  本文关键词：猪传染性胃肠炎病毒N基因的荧光定量PCR检测方法建立及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

《四川农业大学》 2015年

猪传染性胃肠炎病毒N基因的荧光定量PCR检测方法建立及初步应用

李蕊彤  

【摘要】：猪传染性胃肠炎(TGE)是一种重要的仔猪病毒性腹泻病。TGEV主要感染2周龄以内的仔猪,引起严重的水样腹泻、呕吐、脱水、死亡症状,死亡率达到100%。TGE的准确诊断对防控该病非常重要。本研究以TGEV　N基因为基础,建立了检测TGEV的荧光定量PCR方法,为该病的临床诊断和疫苗含量监控提供一种更准确、灵敏的定量检测方法。本研究根据TGEV分离株(SC-H株)的N基因设计了三对引物进行PCR,扩增的目的基因片段分别为236bp、186bp.236bpo扩增目的基因与载体pMD-19(Simple)连接,再转化到DH5α感受态细胞中构建重组质粒。提取阳性重组质粒pMD-N1、pMD-N2和pMD-N3,测定三种阳性质粒的OD260值和OD280值,将OD260值换算成拷贝数,并进行PCR鉴定和测序。将重组质粒以10倍梯度稀释10个梯度以制备标准品,比较了三对引物的效果,选用第二对引物对应的阳性质粒进行荧光定量PCR,建立TGEV N基因的SYBR Green-I实时荧光定量PCR法。优化确定了退火温度,最佳反应程序,TGEV实时荧光定量PCR的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.996,扩增效率为101.8%。该方法特异性好,PEDV、PoRV、PRRSV、CSFV、JEV无Ct值,均为阴性；具有良好的重复性,批内重复和批间重复试验的变异系数5%；敏感性实验表明,该方法可测出的最低拷贝数为6.37×101拷贝/μL(常规PCR能够检测出的最低拷贝数为6.37×103拷贝/μL),灵敏度比常规PCR灵敏100倍。将建立的荧光定量PCR方法进行了应用评价：1.临床病料的检测：收集来自四川彭州、蒲江、茂县、攀枝花、乐山、绵阳、安岳、重庆涪陵、福建龙岩、山东肇东等地的临床仔猪腹泻病料80份,以该方法进行检测,并与常规PCR进行比较,结果表明：普通PCR的结果是阳性病料8份,利用本实验建立的方法的结果是阳性病料15份,常规PCR检测出的阳性样品以荧光定量PCR检测均为阳性。2.我国部分商品TGEV疫苗的病毒含量检测：用该方法对基层可购买到的几种商品TGEV疫苗进行了随机抽检,测定病毒含量,结果表明：A公司的TGEV活疫苗含量较高,分别为：11089.35、7551.55、8041.59、12752.23、8097.97、9509.51、9916.58拷贝/μL;B、C、D公司的TGEV灭活疫苗含量非常少。本研究成功的建立了TGEVN基因SYBR Green-I实时荧光定量PCR法,能够快速、准确地对TGEV进行定性和定量测定,为该病的准确诊断、疫苗含量的监测等提供了新的技术。

【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【目录】：

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