微生物谷氨酰胺转胺酶性质的研究

发布时间：2018-04-11 08:13

  本文选题：微生物谷氨酰胺转胺酶 + 稳定性　； 参考：《华东师范大学》2017年硕士论文

【摘要】：谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,简称TGase,EC2.3.2.13)可以催化蛋白质或多肽分子发生交联反应,被广泛应用于食品领域。近年来,TGase在生物技术和医学领域有新的应用,TGase被广泛的应用于蛋白质或多肽与DNA、化学材料、药用蛋白的特异性结合,同时TGase也被开发作为医用止血材料。商业化的TGase主要是茂源链霉菌来源的微生物谷氨酰胺转胺酶(简称MTGase),但目前市售的MTGase产品纯度较低,稳定性参差不齐,无法满足各个领域对其品质的要求,特别是生物技术和医学领域。所以如何提高商业化的MTGase的纯度和稳定性成为亟待解决的问题。为了解决以上存在的问题,本研究以茂源链霉菌来源的MTGase为研究对象,首先建立了快速检测和筛选不同稳定性MTGase的方法;然后从MTGase结构和纯度两个方面对MTGase的稳定性进行研究;通过对不同结构MTGase的研究,得到MTGase异构体比例与MTGase稳定性之间的关系;最后对MTGase进行精细纯化,去除了 MTGase中杂质对其稳定性的影响,从而得到稳定性高、纯度高的MTGase。主要结论如下:1、建立了 MTGase稳定性的检测及筛选方法。电泳检测法:将MTGase溶解于缓冲液A和缓冲液B中,然后进行SDS-PAGE或Native-PAGE检测。A1/A2或A1/A3与MTGase稳定性呈正相关(A1:缓冲液A中MTGase在SDS-PAGE中条带面积;A2:缓冲液B中MTGase在SDS-PAGE中条带面积;A3:缓冲液A中MTGase在Native-PAGE中条带面积)。37℃保存加速法:液体MTGase在37℃条件下保存1-5天,可以准确判断MTGase的稳定性。结合两个方法,当A1/A2或A1/A3比值大于0.7,则37℃条件下保存5天酶活保存率大于80%;当A1/A2或A1/A3比值小于0.2,则37℃条件下保存5天酶活保存率小于60%。因此可以通过这两个方法准确筛选出稳定性高的MTGase。2、发现并分离得到不同结构的MTGase,即MTGase的异构体(MTG I1和MTG 12)。并确立了异构体比例与MTGase稳定性之间的关系。用pH介导的阳离子交换层析方法分离得到MTGase的异构体。并建立了稳定性高,可重复性好的MTGase异构体分离方法。具体方法为:以pH5.5 20mM的磷酸缓冲液作为起始缓冲液,将MTGase溶解于相应的缓冲液中,pH9.0 20mM的磷酸缓冲液以0-100%、30个柱体积的条件对MTGase进行洗脱,流速为1mL/min,所用离子交换柱为Hitrap SP FF(1mL)。得到的MTGI1和MTG12的总回收率在80%以上,MTGI1的收率为60-65%,MTG12的收率在15-20%,MTGI1的洗脱pH范围在5.5-6.5之间,MTG12的洗脱pH范围在6.6-7.5之间,MTG I1和MTG 12的分离率约1.2。在一定范围内,MTG I2/MTGI1的比值与MTGase的稳定性呈现负相关。3、MTGase异构体性质的研究。MTG I1和MTG 12分子量均为37.816KDa,N末端四个序列均为Asp-Ser-Asp-Glu。MTGI1的等电点为7.94,MTGI2的等电点为8.03。30-70℃时,MTG I1的催化活性显著高于MTG 12,在30℃以下MTG 12的催化活性显著高于MTG I1;40-60℃时,MTG I1的温度稳定性显著高于MTG12。MTG I1的最适反应pH为6-8,MTG12的最适反应pH为5-8,MTG12的最适反应pH范围比MTG I1广;37℃时,MTG I1的pH稳定性范围为pH5-9,MTG 12的pH稳定性范围为pH5-8,4℃时,MTG I1的pH稳定性范围为pH4-10,MTG 12的pH稳定性范围为pH5-10,MTG I1的pH稳定性范围比MTG 12广;37℃时,在pH6和pH5范围内,MTGI1的稳定性显著高于MTGI2,4℃时,在7pH10和pH5范围内,MTG I1的稳定性显著高于MTG 12;说明MTG I1的高温耐受性和酸碱耐受性要明显高于MTG 12。MTG I1和MTG 12的Vmax分别为0.84U/mL*min和0.56U/mL*min;MTG I1 和 MTG 12 的 Km 值分别为 19.08mM/mL 和 10.49mM/mL;说明MTG 12与底物的亲和能力高于MTG I1。MTGase中MTG I1和MTG 12的比例和含量是一定的,但MTG I1存在动态转化现象,将MTGase中的MTG 12分离后,MTG I1将继续向MTG 12转化,MTG 12则无法向MTG I1转化。因此,MTG I1的比例越高,MTGase的稳定性越高。4、MTGase的精细纯化。用离子强度介导的阴离子交换层析方法对MTGase进行精细纯化,具体方法为:以pH7.0 10mM的磷酸缓冲液作为起始缓冲液,将MTGase溶解于相应的缓冲液中,pH7.0 10mM+1M氯化钠的磷酸缓冲液以0-20%、25个柱体积的条件对MTGase进行洗脱,流速为1mL/min,所用离子交换柱为Hitrap QFF(1mL)。上样量为5-10mg,纯化得到的MTGase回收率65%,比酶活为23.62U/mg,此方法具有可重复性。MTGase进一步脱盐和冷冻干燥后,回收率约47%,比酶活为25.88 U/mg。阴离子交换柱体积放大到200 mL时,MTGase回收率达77%,比酶活达27.89U/mg。纯化得到的MTGase稳定性提高,电泳纯度达95%以上。因此,可以通过此方法可以纯化得到纯度高、稳定性高的MTGase。综上所述,本研究通过对不同批号MTGase的对比研究,建立了快速的MTGase稳定性检测方法,从而可以快速有效的筛选出稳定性高的MTGase;通过对不同结构MTGase稳定性的研究,得到MTGase结构与稳定性之间的关系;为了进一步提高MTGase的纯度和稳定性,对MTGase进行精细纯化,并得到稳定性高,纯度高的MTGase,从而使MTGase更好的应用于各个领域。
[Abstract]:In recent years , TGase has been widely used in the fields of biotechnology and medicine . The results showed that MTGI1 had a pH range of 6 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 , and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 and MTGI1 had a pH range of 5 - 8 . The stability of MTGI1 was higher than that of MTGI2 . MTGase was purified by ion - intensity - mediated anion exchange chromatography . MTGase was purified by ion - intensity - mediated anion exchange chromatography . In order to improve the purity and stability of MTGase , MTGase with high stability and high purity can be obtained . MTGase with high stability and high purity can be obtained , so that MTGase can be applied to various fields .

【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q936

【参考文献】

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本文编号：1735152