细菌漆酶的结构设计与功能进化

发布时间：2018-05-19 15:17

  本文选题：枯草芽孢杆菌 + 突变体　； 参考：《吉林大学》2017年硕士论文

【摘要】：枯草杆菌漆酶是一种蓝色多铜氧化酶,它能够参与木质素的降解,并且催化多种芳胺类小分子物质的氧化,是一种环境友好型酶。本论文从原始的产漆酶菌株CAR2出发,通过紫外线诱变的方法得到具有较高漆酶活性的菌株ZNXH1,两者所产漆酶分别为CAR2(R155)、CAHH1(R155H、M157H、A158T),而后者的催化活力明显高于前者。为了建立漆酶功能与结构的相关性,我们利用定点突变的方法在漆酶的第二保守区选定了155、157、158三个关键位点,设计并获得了六种突变体漆酶:CAW(R155W)、CAWH(R155W,M157H)、CAWH1(R155H、M157H、A158E)、CAHE(R155H、A158E)、CAHH(R155H、M157H)和CAH2(R155H),其中CAR2、CAH2(R155H)为共享的原始漆酶和对照突变体漆酶。上述八种漆酶在大肠杆菌中实现了有效的活性表达,其分子量均约为66 kDa。对上述八种漆酶的性质与功能进行了对比分析,取得如下结果:(1)CAHH1及所有六种突变体漆酶(CAW、CAWH、CAWH1、CAHE、CAHH、CAH2)的催化活力均高于野生型漆酶CAR2,其中尤以CAHH1及CAHH的催化活力为高,其次为CAH2与CAWH,说明枯草杆菌漆酶的His155、His157、Thr158位点对漆酶活性有明显的正效应或对于漆酶的催化活性是必需的;(2)除野生型菌株CAR2的最适温度为50℃,另外七种漆酶的最适温度均为60℃,而且CAHH1、CAHH、CAH2的热稳定性最高,其次是CAWH1与CAHE,它们在40-80℃下孵育1h后,均可以保持约70%以上的活力,说明枯草杆菌漆酶的His155、His157位点对漆酶的热稳定性也有较大的贡献;(3)野生型漆酶CAR2的最适pH为4.0,剩余七种漆酶的最适pH为4.6,说明CAHH1与所有突变体漆酶的催化条件略有碱移,这显然对漆酶的应用是有益的。W155类突变体漆酶(CAW、CAWH、CAWH1)的酸碱稳定性明显高于其它漆酶,说明W155位点对提高漆酶的酸碱稳定性,特别是在弱碱性条件下的稳定性有明显贡献;(4)Co~(2+)、Mn~(2+)和Mg~(2+)对漆酶有激活作用,其中Mn~(2+)的激活作用最为显著;(5)动力学分析表明,His155、His157、Glu158/Thr158位点对提高漆酶的催化效率是有利或必须的;(6)在漆酶通用介体ABTS存在下,原始漆酶和突变体漆酶均在3 h之内可以使靛蓝胭脂红(蒽醌类)、刚果红(偶氮类)、结晶紫(三苯甲烷类)染料有效脱色,脱色率达70%以上,其中CAHH和CAHH1对靛蓝胭脂红和刚果红的脱色率达到了90%以上,对结晶紫的脱色率可达80%以上,然而所有漆酶对活性亮蓝(蒽醌类)、甲基红(偶氮类)的脱色效果较低(低于20%),说明漆酶的第二保守区对漆酶催化的底物有一定的选择性,同时His155、His157、Thr158位点对提高漆酶的应用性也是有利的。另一方面,所有漆酶对靛蓝胭脂红的脱色均不依赖介体ABTS的存在,但催化结晶紫时确是非常依赖介体ABTS存在的。在有Mn~(2+)存在的条件下,除了原始漆酶CAR2外,其它漆酶对靛蓝胭脂红、刚果红和结晶紫的脱色率均有明显提高,催化3 h后,脱色率均接近100%,其中突变漆酶CAHH和CAHH1对结晶紫的脱色率效力最高,作用1.5 h后达到100%。这些结果说明,这些漆酶,尤其是第二组(CAWH、CAWH1、CAHE)和第三组漆酶(CAHH1、CAHH、CAH2)有望成为有潜力的工业用酶。总体上来说,我们得到的突变体漆酶CAHH和CAHH1在比活力、热稳定性以及脱色率、对环境的敏感性等方面都表现较突出的特性,更好的满足了工业需要。通过对漆酶第二保守区关键位点氨基酸残基的设计改造,通过对比分析所有漆酶在活力、温度稳定性以及脱色率、对环境的敏感性等方面的差异,建立了漆酶在该区域的结构与功能的相关性,为提高漆酶的应用性,并针对不同的目的及漆酶应用条件,设计出不同的高效漆酶等奠定了基础。
[Abstract]:Bacillus subtilis laccase is a kind of blue poly copper oxidase, which can participate in the degradation of lignin and catalyze the oxidation of a variety of small aromatic amines. It is a kind of environment-friendly enzyme. From the original laccase producing strain CAR2, the strain ZNXH1 with high laccase activity was obtained by ultraviolet mutagenesis. Both of them were produced. Laccase was CAR2 (R155), CAHH1 (R155H, M157H, A158T), and the catalytic activity of the latter was significantly higher than that of the former. In order to establish the correlation between the function and structure of laccase, we selected 155157158 three key loci in the second conservative region of laccase, and designed and obtained six mutant laccase, CAW (R155W), CAWH (R155). W, M157H), CAWH1 (R155H, M157H, A158E), CAHE (R155H, A158E), CAHH (R155H, M157H) and the control mutant laccase. These eight laccase are active in Escherichia coli, with a molecular weight of about 66 of the eight laccase properties and functions of the above mentioned laccase The results are as follows: (1) the catalytic activity of CAHH1 and all six mutant laccase (CAW, CAWH, CAWH1, CAHE, CAHH, CAH2) is higher than that of the wild type laccase CAR2, especially the catalytic activity of CAHH1 and CAHH is higher, followed by CAH2 and CAWH, indicating that the laccase activity has obvious positive effect on laccase activity. The catalytic activity of the laccase is necessary. (2) the optimum temperature of the wild type strain CAR2 is 50, the optimum temperature of the other seven laccase is 60, and the thermal stability of CAHH1, CAHH and CAH2 is the highest, followed by CAWH1 and CAHE. After incubating 1H at 40-80 degrees, they can all maintain about 70% of the vitality, indicating the laccase of Bacillus subtilis. His155, His157 loci also have a great contribution to the thermal stability of laccase, (3) the optimum pH of the wild type laccase CAR2 is 4, the optimum pH of the remaining seven laccase is 4.6, indicating that the catalytic condition of the laccase with all the mutant laccase is slightly alkaline, and the application of the laccase is obviously acidic and stable of the beneficial.W155 mutant laccase (CAW, CAWH, CAWH1). The qualitative significantly higher than other laccase, indicating that the W155 site has a significant contribution to improving the stability of the laccase acid base, especially in the weak alkali conditions. (4) Co~ (2+), Mn~ (2+) and Mg~ (2+) have the activation effect on laccase, and Mn~ (2+) is most significant; (5) kinetic analysis shows that His155, His157, Glu158/Thr158 loci are to be extracted. The catalytic efficiency of high laccase is beneficial or necessary. (6) in the presence of laccase general medium ABTS, the original laccase and mutant laccase can make indigo carmine (anthraquinone), Congo red (azo) and crystal violet (triphenyl methane) dyestuff in 3 h, and the decolorization rate is more than 70%, of which CAHH and CAHH1 are to indigo carmine and Congo The decolorization rate of red is above 90% and the decolorization rate of crystal violet is above 80%. However, the decolorization effect of all laccase to active blue (anthraquinone) and methyl red (azo) is lower (less than 20%). It shows that the second conserved area of laccase is selective to the substrate of laccase catalyzed by laccase. At the same time, the His155, His157 and Thr158 loci can improve laccase. Application is also beneficial. On the other hand, all laccase decolorization of indigo carmine does not depend on the presence of mediator ABTS, but the catalytic crystal violet depends very much on the presence of mediator ABTS. In the presence of Mn~ (2+), the decolorization rate of indigo carmine, Congo red and crystal violet is evident in addition to the original laccase CAR2. The decolorization rate was close to 100% after 3 h catalysis, in which the mutant laccase CAHH and CAHH1 had the highest decolorization effect on crystal violet. After 1.5 h, the results showed that the laccase, especially the second groups (CAWH, CAWH1, CAHE) and third groups of laccase (CAHH1, CAHH, CAH2) were expected to be potential industrial enzymes. The mutant laccase CAHH and CAHH1 showed prominent characteristics in the specific activity, thermal stability, decolorization rate and environmental sensitivity, and better meet the industrial needs. Through the design and transformation of the amino acid residues at the key site of the laccase second conserved region, all laccase was compared and analyzed in vitality and temperature stability by comparison and analysis. The correlation between the structure and function of laccase in this area was established for the difference of the decolorization rate and the sensitivity to the environment. It laid the foundation for improving the application of laccase and designing different high efficiency laccase for different purposes and the application conditions of laccase.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q936

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本文编号：1910602