原儿茶酸3,4-双加氧酶的酶学性质及其固定化的研究

发布时间：2018-05-29 10:12

  本文选题：原儿茶酸3 + 4-双加氧酶　； 参考：《华东理工大学》2017年硕士论文

【摘要】：原儿茶酸代谢途径在芳香化合物的生物降解中起着关键性的作用,原儿茶酸3,4-双加氧酶(P34O)是β-酮己二酸途径中的原儿茶酸分支途径催化芳香化合物的开环步骤的关键酶。首先本研究以根瘤菌属(Rhizobium sp.LMB-1)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.LMB-5)的基因组为模板扩增得到编码P34O大小均约为1300 bp的基因片段。此外由重组菌LMB-1/proP34O和LMB-5/proP34O表达的两重组P34O均由两类亚基组成,分子量与预测大小接近。为了分析重组P34O的特性,考察了两重组P34O的酶学特性差异,结果表明两重组P34O的最适pH均为7.5,重组LMB-1/proP34O的P34O最适温度为60℃,而重组LMB-5/proP34O 的 P34O的最适温度为 50 ℃,在 60 ℃下孵育 450 min,LMB-1/proP34O的重组酶的相对活力缓慢降低,而LMB-5/proP34O的酶在60 ℃仅孵育15 min,酶活力降至20%。在本研究中,只有Fe3+对重组LMB-l/proP34O的P34O有激活作用,而Fe3+,Al3+和Mg2+都对重组LMB-5/proP34O的P34O有激活作用。此外,在芳香化合物邻苯二甲酸酯(PAEs)的诱导下,两株野生菌中编码P34O的pcaG及pcaH基因的转录水平均有所提高,由此表明P34O的基因表达可受到一些芳香化合物的诱导。为进一步提高酶的理化性质,以磁性纳米颗粒Fe_3O_4为载体通过戊二醛共价交联法固定LMB-1/proP34O的P34O并对其酶学性质进行研究。结果表明固定化酶比游离酶的最适温度提高了10℃,而两者最适pH均为7.5,且固定化酶表现出更优越的热稳定性。此外,由反应动力学参数测定结果知,固定化酶的Km,Vmax,Kcat值分别为159.29μM,19.16 μM/min和958/min,而游离酶的对应的值分别为65.34 μM,12.29μM/min和615/min。同时,以磁性纳米粒子Fe_3O_4为载体的固定化P34O重复利用10次仍保留64%的相对酶活。
[Abstract]:Protocatechuic acid metabolism pathway plays a key role in the biodegradation of aromatic compounds. Protocatechuic acid 3-dioxygenase (P34O) is the key enzyme in the catalytic ring opening of aromatic compounds by the protocatechuic acid branching pathway of 尾 -keto-adipic acid pathway. Firstly, the genome of Rhizobium sp. LMB-1 and Acinetobacter sp. LMB-5) was used as a template to amplify the genome of Rhizobium sp. LMB-5. The gene fragment encoding P34O was about 1300 BP in size. In addition, the two recombinant P34O expressed by LMB-1/proP34O and LMB-5/proP34O were composed of two subunits, and the molecular weight was close to the predicted size. In order to analyze the characteristics of recombinant P34O, the differences of enzymatic properties between the two recombinant P34O were investigated. The results showed that the optimum pH of the two recombinant P34O was 7.5, the optimum temperature of the recombinant P34O was 60 鈩，

本文编号：1950493