热休克转录因子1对15 kDa硒蛋白基因转录调控的研究

发布时间：2018-05-31 01:40

  本文选题：15kDa硒蛋白 + 热休克转录因子　； 参考：《深圳大学》2017年硕士论文

【摘要】：硒元素在生物体内的功能主要通过各种硒蛋白实现的。15 kDa硒蛋白(Sep15)是人体中25种硒蛋白之一,目前对Sep15的转录调控研究未见报道。本研究主要从转录调控机制以及Sep15在内质网中的功能进行研究,来探讨Sep15的生物学功能。本研究通过生物信息学预测发现,人Sep15基因上游-2055/-248存在热休克转录因子1(HSF1)的结合位点,提示Sep15的基因表达可能受到HSF1的调控。将含有Sep15的核心启动子区域:-818/-248片段的荧光素酶报告基因的启动子活性检测载体(pGL4)和HSF1,共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告系统(DLR)、实时荧光定量(Q-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)分别检测Sep15的核心启动子活性、mRNA水平和蛋白水平。结果显示,过表达HSF1能增强Sep15的核心启动子活性、促进Sep15的转录,提高Sep15的蛋白表达水平。通过染色质免疫共沉淀方法(CHIP)验证了HSF1能结合到Sep15启动子上的5个片段,且其中一个在核心启动子上。热激能够诱导HSF1入核调节相关基因转录。将细胞进行热激处理后,利用双荧光素酶报告系统(DLR)、实时荧光定量(Q-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)分别检测Sep15的核心启动子活性、mRNA水平和蛋白水平。结果显示,热激能增强Sep15的核心启动子活性、促进Sep15的转录,提高Sep15的蛋白表达水平。内质网应激诱导剂衣霉素(Tm)能够上调Sep15表达,且通过复杂的信号通路诱导HSF1调节相关基因表达。Tm处理细胞后,运用双荧光素酶报告系统(DLR)、实时荧光定量(Q-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)分别检测Sep15的核心启动子活性、mRNA水平和蛋白水平。结果显示,与过表达HSF1结果类似,Tm处理显著提高了Sep15的核心启动子活性;在Tm处理的同时过表达HSF1,对核心启动子活性提高的效果进一步增强。在HEK293T细胞中,Sep15的转录水平随着Tm处理时间的延长而提高;而在N2a细胞中,Sep15的转录水平随着Tm处理时间先升高后降低。同时,蛋白免疫印迹检测Sep15表达结果与转录水平的变化一致,表明Tm处理引起的Sep15转录与表达变化具有细胞特异性。放线菌素D会抑制mRNA的合成。放线菌素D的处理结果显示,Tm处理是通过提高Sep15转录水平,进而促进Sep15的蛋白表达。CHIP结果显示,Tm处理后,可能诱导HSF1入核,与Sep15启动子结合,调节Sep15转录,进而提高Sep15的蛋白水平,从而参与到内质网质量控制或其它生物学事件,促进细胞存活。综上所述,在过表达HSF1或内质网应激下,HSF1入核结合Sep15启动子区域,调节Sep15转录,促进Sep15表达。而在内质网应激下,Sep15与自噬相关蛋白LC3表达趋势相似,预示其可能是促存活机制中的一个重要成员。
[Abstract]:The function of selenium in vivo is mainly realized by various selenoproteins. Sep15) is one of the 25 kinds of selenium proteins in human body. So far, the transcriptional regulation of Sep15 has not been reported. In order to explore the biological function of Sep15, the mechanism of transcriptional regulation and the function of Sep15 in endoplasmic reticulum (ER) were studied in this study. In this study, bioinformatics predicted that there was a binding site of heat shock transcription factor 1HSF1 (-2055 / -248) in the upstream of human Sep15 gene, suggesting that the gene expression of Sep15 might be regulated by HSF1. The promoter activity detection vector pGL4 of luciferase reporter gene containing the core promoter region of Sep15: -818 / -248 and HSF1 were co-transfected into HEK293T cells. Double luciferase reporting system (DLRX), real-time fluorescence quantitative quantitation (Q-PCR) and Western blot (Western blot) were used to detect the mRNA level and protein level of core promoter of Sep15. The results showed that overexpression of HSF1 could enhance the core promoter activity of Sep15, promote the transcription of Sep15 and increase the expression of Sep15 protein. Five fragments of HSF1 binding to Sep15 promoter were confirmed by chromatin immunoprecipitation method, and one of them was on core promoter. Heat shock can induce HSF1 into the nucleus to regulate the transcription of related genes. After heat shock treatment, Sep15 core promoter activity mRNA and protein level were detected by double luciferase report system (DLRX), real-time fluorescence quantitative quantitation (Q-PCR) and Western blotting (Western blot), respectively. The results showed that heat shock could enhance the core promoter activity of Sep15, promote the transcription of Sep15 and increase the expression of Sep15 protein. Endoplasmic reticulum stress inducer (Tm) can up-regulate the expression of Sep15, and induce HSF1 to regulate the expression of related genes through complex signaling pathway. Double luciferase reporting system (DLRX), real-time fluorescence quantitative quantitation (Q-PCR) and Western blot (Western blot) were used to detect the mRNA level and protein level of core promoter of Sep15. The results showed that the activity of core promoter of Sep15 was significantly increased by Tm treatment similar to that of overexpression of HSF1, and the activity of core promoter was further enhanced by over-expression of HSF1 at the same time of TM treatment. The transcriptional level of HEK293T cells increased with the prolongation of TM treatment time, while in N2a cells, it increased first and then decreased with TM treatment time. At the same time, the results of Sep15 expression by Western blot were consistent with the changes of transcription level, which indicated that the changes of Sep15 transcription and expression induced by TM treatment were cell-specific. Actinomycin D inhibits the synthesis of mRNA. The results of actinomycin D treatment showed that Tm treatment enhanced the Sep15 transcription level, and then promoted the expression of Sep15 protein. Chip results showed that HSF1 might be induced into the nucleus, bind to Sep15 promoter and regulate Sep15 transcription after treatment with TM. Furthermore, the protein level of Sep15 was increased, which involved in the quality control of endoplasmic reticulum or other biological events, and promoted cell survival. In conclusion, under the stress of overexpression of HSF1 or endoplasmic reticulum (ER) stress, HSF1 is involved in nucleation-binding Sep15 promoter, which regulates the transcription of Sep15 and promotes the expression of Sep15. Under endoplasmic reticulum stress, the expression trend of LC3 was similar to that of autophagy related protein LC3, suggesting that it might be an important member of survival promotion mechanism.
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：1957783