家蚕NEDDylation修饰调控细胞周期研究

发布时间：2018-11-06 11:11

【摘要】：家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目重要的模式昆虫,其一生要经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育过程,蛋白质在这些生命过程中执行着不同的功能。而蛋白质功能的发挥要经过一系列的蛋白质翻译后修饰,如甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化修饰等。其中泛素化修饰是泛素蛋白G76甘氨酸识别并结合底物赖氨酸残基位点,一方面介导蛋白进入26S蛋白酶体复合物,使底物蛋白发生降解,另一方面也可能与底物蛋白结合发挥非降解作用,参与其它生物学过程。同时泛素蛋白也可以形成多聚泛素链,被磷酸化、乙酰化等修饰。随着对泛素化修饰研究的逐步深入,在生物体内又发现一类在结构和进化关系上与泛素都极为相似的类泛素蛋白家族,如SUMO、NEDD8等。它们在功能上与泛素有较大的差异,同时也可以修饰泛素蛋白链。研究发现,类泛素化修饰不仅可以调控泛素化修饰,间接发挥降解靶蛋白作用,而且还具有免疫调节、DNA损伤修复、亚细胞定位和细胞周期调控等功能。NEDD8是一类目前发现的与泛素序列相似度最高的类泛素蛋白,蛋白序列高度保守。目前越来越多的证据表明NEDDylation修饰在参与细胞周期调控方面的作用是必需的。家蚕有关NEDDylation修饰的研究还鲜有报道,通过本研究我们希望阐释NEDDylation修饰在家蚕细胞周期调控方面的作用,以及鉴定家蚕中发生NEDDylation修饰的底物蛋白,同时泛素蛋白和类泛素蛋白与底物的修饰位点都是赖氨酸残基位点,而且多聚泛素链可以受到类泛素化修饰,类泛素链也可以受到泛素化修饰,几种修饰之间可能存在竞争与协同关系。因此本研究将为今后探讨家蚕泛素化修饰与类泛素化修饰之间协同竞争的关系奠定基础。通过本研究,我们主要得出了以下结论:(1)家蚕NEDDylation修饰基因的鉴定、表达特征及亚细胞定位家蚕BmNedd8基因编码77个氨基酸残基,蛋白序列高度保守,第76位有保守的二甘氨酸激活位点。进化树分析发现家蚕Bm Nedd8与黑脉金斑蝶聚为一支,与物种间进化较为一致。鉴定并克隆了家蚕NEDDylation修饰酶基因,胚胎发育时期表达特征分析显示修饰基因在各时期均持续表达,5龄3天各组织表达特征显示修饰基因在各组织表达无特异性。BmNedd8在有丝分裂间期主要定位在细胞核,随着分裂期的进行,逐渐定位到细胞质和纺锤体,分裂末期,又定位到染色体。其定位与有丝分裂染色体的分布密切相关,暗示家蚕NEDDylation修饰可能参与调控细胞周期。(2)家蚕NEDDylation修饰参与细胞有丝分裂调控通过合成参与NEDDylation修饰基因的双链RNA,干涉处理BmN4-SID I细胞,在转录水平和蛋白水平上均可以检测到明显的干涉效果。干涉处理家蚕细胞NEDDylation修饰基因,导致细胞周期分布出现G2/M期滞留现象,表明NEDDylation修饰可以调控细胞周期。同时干涉掉修饰基因的细胞导致有丝分裂中期染色体的排布发生紊乱,无法定向排列于赤道板,纺锤体无法与染色体结合将其拉向细胞两极从而导致细胞停留在分裂期,引起G2/M期细胞数增多,表明NEDDylation修饰可以通过影响染色体的排布进而调控细胞周期进程。(3)家蚕NEDDylation修饰底物的鉴定与功能分析通过构建融合FLAG标签蛋白的BmNedd8野生型与BmNedd8羧基端GG识别位点缺失型和GG→AA突变型转基因细胞系,免疫沉淀富集底物蛋白和LC-MS/MS鉴定,一共鉴定到了58个发生特异修饰的底物蛋白。其中31%为已报道的与核糖体形成相关蛋白。此外,还有丰度较高的与有丝分裂纺锤体微管形成相关蛋白:肌动蛋白、β-Tubulin蛋白等,与代谢相关的ATP合成酶等,与SUMOylation修饰相关的SUMO E3连接酶RanBP2,表明家蚕细胞可能通过对这些底物蛋白的修饰从而参与调控细胞周期和基础代谢进程。底物蛋白修饰位点附近氨基酸较为灵活,无保守基序。GO功能分析显示多数蛋白参与色素沉着和代谢进程,部分蛋白也参与到胞内组分的定位、免疫调节、核糖体结构形成等。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q23

【参考文献】