不同种属SAMHD1核定位信号对其抗病毒能力的影响

发布时间：2018-12-20 05:50

【摘要】：宿主限制因子是宿主体内表达的,能够对抗病毒感染的蛋白。参与抑制人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)的宿主限制因子包括APOBEC3、Trim5α、BST-2和SAMHD1等。SAMHD1作为宿主限制因子于2011年由Laguette等人发现,它是一个由SAM结构域和HD结构域组成的核定位蛋白。其中HD结构域具有d NTP水解酶(d NTPase)活性,能够将细胞中的d NTP代谢成为脱氧核糖核苷以及游离的三磷酸基团。SAMHD1的d NTPase活性能够调控细胞内的d NTP含量,从而抑制HIV-1的逆转录过程,发挥其抗病毒功能。然而,HIV-2和猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)表达的Vpx蛋白能够降解SAMHD1,从而使病毒恢复复制进程。研究表明当删除SAMHD1的核定位信号(nuclear location signal,NLS)后,SAMHD1会重新定位至细胞质中,且能够拮抗Vpx的降解,同时增强其抗病毒能力,这说明SAMHD1的核定位信号能够影响其抗病毒作用。另外,对灵长类动物SAMHD1与Vpx的相互作用研究发现,SAMHD1在一些氨基酸位点的改变会影响Vpx引发的降解作用,而对于与人类亲缘关系较远的非灵长类,则可能存在更多影响SAMHD1与Vpx相互作用的因素。目前对于其它物种SAMHD1的结构和功能研究鲜有描述,因此,本论文选择常被当作HIV模式生物的猫以及本实验组在APOBEC3G(A3G)与Vif相互作用研究中发现与人源A3G-Vif有着不同结合模式的牛作为研究对象,探究不同种属SAMHD1的核定位信号对其抗病毒能力的影响机制。旨在进一步了解Vpx与SAMHD1的相互作用模式以及SAMHD1的抗病毒机制。在本研究中,我们首先分析了人源(homo)、猫源(feline)以及牛源(bovine)SAMHD1的氨基酸序列,序列比对结果表明SAMHD1的核定位信号在人、猫和牛之间具有保守性。细胞定位结果显示三个种属的SAMHD1蛋白在核定位信号缺失后均重定位至细胞质中。在随后的抗病毒感染实验中我们发现,三个种属野生型的SAMHD1均具有抗病毒能力,转染了人源和猫源核定位信号缺失的SAMHD1的TZM-bl细胞更不容易被HIV-2和SIVmac239感染,这说明核定位信号缺失的h SAMHD1和f SAMHD1的抗病毒能力增强。而对于牛源SAMHD1,核定位信号缺失仅能够增强其抗HIV-2感染的能力,而对其抗SIVmac239感染的能力则无明显影响。为了研究三个种属SAMHD1在核定位信号缺失与否时表现出的抗病毒能力差异是否与Vpx对SAMHD1的降解作用有关,我们进行了随后的降解实验。结果发现在HEK 293细胞系中,来源于SIVmac239的Vpx能够明显降解homo-SAMHD1,部分降解bovine-SAMHD1,几乎不能降解feline-SAMHD1。来源于SIVmac239的Vpx Q76A突变体(76位氨基酸是影响Vpx降解SAMHD1的关键位点)相比野生型Vpx能够使homo-SAMHD1和bovine-SAMHD1的降解现象有所回复。去除核定位信号后,Vpx对homo-SAMHD1和bovine-SAMHD1的降解程度也有所回复。考虑到homo-SAMHD1的CTD区(C terminal domain)影响其与SIVmac来源的Vpx的结合,因此结合种属间SAMHD1序列比对结果,我们认为feline-SAMHD1的CTD区与homo-SAMHD1相比存在个别氨基酸差异可能是导致其难以被Vpx降解的一个原因;另一方面我们发现bovine-SAMHD1并不存在类似homo-SAMHD1的CTD区域,但是却仍能够被Vpx部分降解,因此我们在随后检测了Vpx与不同种属野生型以及缺失核定位信号的SAMHD1的相互作用。结果显示,feline/bovine-SAMHD1与homo-SAMHD1类似能够与Vpx结合,且核定位信号的缺失并不影响其与Vpx的结合。另外,考虑到SAMHD1核定位信号的缺失可能会影响其本身作为d NTPase的酶活性以及其发挥d NTPase功能的场所,进而影响其抗病毒能力,因此我们研究了不同种属SAMHD1的d NTPase功能对其抗病毒能力的影响。由于SAMHD1的HD区与d NTPase密切相关,通过序列比对发现人源SAMHD1的第233位组氨酸(影响SAMHD1的d NTPase功能的关键位点)在猫源(第233位)以及牛源(第221位)的SAMHD1中保守,因此我们构建了homo/feline/bovine-SAMHD1H233/221A突变体,并在TZM-bl细胞系中进行了抗病毒感染实验。结果显示突变233/221位组氨酸后,三个种属SAMHD1抗HIV-1的能力均有所下降,因此我们认为SAMHD1的抗病毒作用与其d NTPase活性相关。后续实验将考察核定位信号是否影响SAMHD1的d NTPase活性和细胞内的d NTP水平。综上,本论文对不同种属SAMHD1的核定位信号对其抗病毒能力的影响进行了研究,并从SAMHD1与Vpx的拮抗作用、结合区域和SAMHD1本身的d NTPase活性方面对不同种属SAMHD1在核定位信号有无时表现出的抗病毒能力差异进行了分析和阐释。本论文的研究将有助于进一步理解SAMHD1发挥抗病毒能力的具体机制以及与Vpx的相互作用机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373

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本文编号：2387524