大肠杆菌O157中MpaA蛋白和AspR蛋白的三维结构测定与功能研究

发布时间：2019-04-30 10:53

【摘要】：肽聚糖是组成微生物细胞壁的主要成分,它对细胞完整性,细胞形态及耐受渗透压有着重要的作用。肽聚糖代谢包括合成代谢和降解代谢,代谢过程需要一系列的酶共同完成,缺一不可。在致病性大肠杆菌O157中,有40%-50%的肽聚糖水解产物会被重新利用合成肽聚糖。肽聚糖酰胺酶MpaA作用于胞壁质三肽(Mtp)L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP,负责切割γ-D-Glu与meso-DAP之间的酰胺键。若MpaA活性降低或丧失,则会影响Mtp降解,最终导致肽聚糖合成受到抑制进而影响菌体正常生长。细菌内D-型氨基酸含量很低,且通常由相应的L-型氨基酸通过消旋酶作用生成,谷氨酸/天冬氨酸消旋酶AspR负责将L-Glu或L-Asp通过消旋作用生成相应的D-Glu或D-Asp。D-Glu是肽聚糖组成不可或缺的成分。如果D-Glu合成受阻,会使肽聚糖合成受到阻滞,影响肽聚糖的完整性及自身正常生长,严重时会导致菌体死亡。本论文致力于解析肽聚糖酰胺酶MpaA与谷氨酸/天冬氨酸消旋酶AspR的三维结构,阐明结构与功能的关系。通过克隆基因和构建表达载体、纯化重组蛋白并结晶、收集高分辨率晶体衍射数据、解析蛋白三维结构系等一系列工作阐明MpaA和AspR结构与功能的关系。MpaA和AspR均是潜在的小分子药物作用靶点,本论文的研究结果将为新型小分子药物的研发提供结构学数据。MpaA晶体结构分辨率2.6?。每个不对称单元含有两个蛋白单体分子,每个单体分子含有一个Zn2+。MpaA蛋白单体分子由7个α-螺旋和10个β-折叠组成,呈现金属羧肽酶典型的α/β构象。在氨基酸序列保守性分析基础上,通过比较MpaA、Vh-MpaA和CPA1活性中心,发现:活性中心高度保守,催化氨基酸和Zn2+离子配位氨基酸完全保守,这意味着MpaA的催化反应机制与金属羧肽酶超家族蛋白相同。在MpaA中含有两个重要的loop结构:Tyr133-Asp143loop和Val204-Thr211 loop。其中,Tyr133-Asp143 loop柔性强,发挥活性腔盖子作用,负责调节底物Mtp进入与结合;Val204-Thr211 loop结构有序,影响底物结合的特异性。谷氨酸/天冬氨酸消旋酶AspR游离态晶体分辨率为1.6?,每个不对称单元含有一个蛋白分子,AspR单体蛋白分子含有两个结构域:N端结构域(N1-C101和N216-C228)和C端结构域(N102-C215)。每个结构域均为α/β折叠方式。底物结合态AspR-L-Asp复合物和产物结合态AspR-D-Asp复合物的晶体分辨率分别为1.76?和1.59?。将游离态AspR与底物结合态或产物结合态的AspR进行叠合发现:当产物或底物结合时,AspR不发生构象的开关变化。AspR活性中心有独特催化对Thr83-Cys197,此催化对不同于典型的Cys-Cys催化对。在底物结合态复合物中,底物L-Asp的α-碳原子直接朝向催化对中的Cys197,而在产物结合态复合物中,产物D-Asp的α-碳原子则朝向了催化对中的Thr83。在分析Cys197-巯基和Thr83-羟基活泼性的基础上,本论文首次从结构生物学角度阐明了AspR消旋反应单向性的催化机理。
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【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q936

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