基于水相原位聚合技术的β-葡萄糖苷酶固定化及其性能研究

发布时间：2019-07-12 20:21

【摘要】：固定化酶技术是现代生物催化领域的研究热点,而提高酶的稳定性也是其工业化应用的前提和基础。酶通过固定化以后,可以明显地提高对外界不良环境的抗性。随着生物催化剂在工业生产上的广泛应用,传统单一的酶固定化方法如吸附固定、包埋固定、共价结合固定和交联固定等已经不能满足工业化发展的需求。因此,固定化酶技术的相关研究已经向着双重或者多重的复合固定化以及非传统的酶固定化方向发展。这些新型酶固定化方法给酶的固定化发展提供了一种新的思路,能够有效地解决传统酶固定化技术存在的不足之处,制备出更加符合实际生产应用需求的固定化酶体系。本文以杏仁β-葡萄糖苷酶作为研究对象,基于水相原位聚合技术平台,设计和制备了几种不同尺度、不同形态结构的新型固定化β-葡萄糖苷酶,以提高酶的稳定性。首先分别对所制备的β-葡萄糖苷酶纳米凝胶、交联β-葡萄糖苷酶聚集体(CLEAs)凝胶和杏仁粉凝胶的形态结构进行一系列表征,然后进一步对其制备工艺条件、酶学性质以及催化性能等方面进行系统的研究和讨论,为其工业化应用提供理论基础。主要研究内容如下:(1)采用水相原位聚合技术两步反应制备了 β-葡萄糖苷酶纳米凝胶,通过对制备工艺条件的优化,β-葡萄糖苷酶纳米凝胶的酶活保留率可达81.4%。红外光谱、凝胶电泳、动态光散射、扫描电镜和荧光光谱等分析结果显示,所制备的β-葡萄糖苷酶纳米凝胶为单分子酶纳米凝胶,粒径主要分布在15nm～40nm之间,纳米凝胶层厚度约为3.5nm,而且保持了天然酶蛋白结构。酶学性质研究结果表明,β-葡萄糖苷酶纳米凝胶的Km值为3.61mmol/L,Vmax值为2.52μmol/(min·mg),较天然酶对底物的亲和力仅略有下降,但β-葡萄糖苷酶纳米凝胶的酸碱稳定性、热稳定性、有机溶剂耐受性以及储存稳定性等方面较天然酶都有显著提高。(2)利用β-葡萄糖苷酶纳米凝胶作为催化剂,以葡萄糖和酪醇为底物,在非水相体系中逆水解反应直接糖基化合成红景天苷。对影响合成红景天苷的多种因素如反应体系的有机溶剂种类、含水量、加酶量、pH、温度和底物浓度等作了考察。实验得到最优条件为:以叔丁醇作为有机溶剂,反应体系含水量为5%,加酶量为4.0U/mL,反应体系pH值为6.0,反应温度为60℃,葡萄糖和酪醇的浓度分别为300mmol/L和900mmol/L。在此条件下,经过96h的反应,红景天苷的浓度为71.13mmol/L,收率达到23.7%。(3)采用三相法从苦杏仁粗酶提取液中分离制备β-葡萄糖苷酶。分别研究了有机溶剂种类及浓度、硫酸铵饱和度、体系pH值和温度对三相分离过程的影响。研究结果表明:叔丁醇作为最佳有机溶剂,粗提物与叔丁醇的体积比为1.0:1.5,硫酸铵饱和度为50%,体系最佳pH值为5.0,最佳温度为25℃。在此优化条件下,苦杏仁β-葡萄糖苷酶的纯化倍数达到5.97,酶活回收率为85.7%。(4)以三相法分离制备的杏仁β-葡萄糖苷酶为研究对象,把交联酶聚集体技术和水相原位聚合技术相结合制备了CLEAs凝胶。通过对制备工艺条件的优化,CLEAs凝胶的酶活保留率可达62.7%。形态结构表征结果显示,所制备的CLEAs凝胶的平均粒径约为50.390μm,聚合物壳层厚度在700nm左右。酶学性质研究结果表明,CLEAs凝胶的酸碱稳定性、热稳定性以及有机溶剂耐受性相比于游离酶和CLEAs得到显著提高。在连续催化红景天苷的合成反应中,CLEAs凝胶仍能够保持较高的催化合成效率,其催化效果要远远好于游离酶和CLEAs。(5)以天然杏仁粗粉作为β-葡萄糖苷酶载体,基于水相原位聚合技术成功制备了杏仁粉凝胶,其催化活性为天然杏仁粉的78.8%。通过形态结构表征分析可知,所制备的杏仁粉凝胶的平均粒径约为45.437μm,表面聚合物壳层厚度仅有460nm。酶学性质研究结果表明,表面具有聚合物壳层的杏仁粉凝胶在酸碱稳定性、热稳定性、有机溶剂耐受性以及重复操作稳定性等方面相比于天然杏仁粉都得到了显著提高。在连续进行5个批次反应合成红景天苷时,红景天苷的平均收率可达16.1%,而其平均催化合成能力为3.63g/(L·U),与天然杏仁粉相比杏仁粉凝胶表现出绝对的生产优势,因此具有广泛的工业应用前景。
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q814.2

【参考文献】