新型N-糖基转移酶酶学性质以及蛋白N-糖链修饰的研究

发布时间：2019-08-20 08:55

【摘要】：糖类(包括单糖,寡糖和多糖)及糖缀合物在很多关键复杂的生命活动中发挥着非常重要的作用,是生物体中是不可缺少的。脂多糖由类脂A(内毒素)、核心多糖和O抗原(OPS)构成,是革兰氏阴性菌细胞外特有的组成成分。O抗原位于细菌表面,通常以O抗原糖链的长短,将O抗原划分为三种类型:long型、intermediate 型和 short 型。我们课题组已将细菌N-糖基化系统与大肠杆菌的O抗原合成过程相结合,在细菌体内生成糖-蛋白缀合物疫苗,对纯化的蛋白进行了 Western blot验证及MALDI-TOF-MS 验证。近年来,研究发现一种新的糖基转移酶HMW1C,HMW1C是一种细胞质中的N-糖基转移酶,可以直接利用细胞质中游离的UDP-Glc或UDP-Gal,将其直接转移至多肽的天冬酰胺残基上,这是与传统的N-糖基转移酶PglB明显不同的,被称为新的N-糖基转移酶。由于HMW1C的晶体结构不容易得到,所以目前研究最透彻的是与其在氨基酸序列上高度同源的糖基转移酶ApNGT,来源于胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropnemoniae)。ApNGT属于GT41糖基转移酶蛋白家族,其包含三个不同的结构域,N末端的α螺旋AAD结构域和C末端由两个Rossman-like形成的GT-B折叠结构域,以及AAD与GT-B之间形成的凹槽。本论文的第二章是选取了两个氨基酸序列上与ApNGT同源性较高的,分别来源于嗜沫嗜血杆菌(Aggregatibacteraphrophilus)和海藻糖巴氏杆菌(Bibersteinia trehalosi)的N-糖基转移酶AaNGT和BtNGT。对其基本的酶学性质进行研究,包括最适温度,pH和金属离子对其活性的影响。还选取了一些UDP糖衍生物,研究AaNGT,BtNGT和ApNGT的糖基供体底物特异性。我们发现AaNGT利用UDP-Glc的效率是最高的,并且AaNGT可以利用特殊的UDP-Sugar衍生物 UDP-GlcNH2。文中的第三章是利用生物发酵一步生产糖蛋白,主要是利用改造菌株E.coli W3110 △waal pBAD24-mbp pACT3-pglb,E.coli W3110 的 O抗原仅由一个GlcNAc组成,在敲除O抗原连接酶waal基因之后,利用PglB理论上可以将周质空间中游离的脂载体的GlcNAc转移至载体蛋白MBP上,形成MBP-GlcNAc。我们对发酵产生的蛋白进行糖基化的验证。利用这个平台我们可以在体外利用不同的糖基转移酶对糖链进行修饰,得到各种各样糖链的糖蛋白,这将为糖蛋白的发展产生深远的影响。本文章的第四章主要是关于用wzz基因调控糖链长度的探索,我们选取不同的 wzz 基因:E.coli O86:B7 wzz(short 型),E.coli O157:H7 wzz(intermediate 型)和E.coli O127 wzz(long型)。利用ccdB毒蛋白反向筛选和体外同源重组的技术将三种不同来源的wzz插入质粒中。接着构建表达菌株E.coli W3110 △waal pYES1L-O157 rfb pBAD24-mbp-pglb,发酵产生糖蛋白并对其糖链的长短进行鉴定。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55

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本文编号：2528513