黄色粘球菌中四型菌毛蛋白与胞外多糖特异性结合关键位点的研究

发布时间：2020-01-26 05:21

【摘要】：作为粘细菌的模式菌,黄色粘球菌具备多细胞水平的典型社会性特征,能够进行复杂多样化的细胞行为并贯穿于其生命周期的各个环节,主要包括:在固体介质表面进行的群体细胞运动过程;群体细胞的捕食过程;子实体的发育。其中社会性细胞运动(S运动)是黄色粘球菌进行捕食和分化发育的行为基础,其分子机制的解析对黄色粘球菌多细胞水平的社会性行为研究具有重要的理论指导意义。S运动系统主要介导了黄色粘球菌细胞在固体表面的群体运动过程,与铜绿假单胞菌的颤动系统非常类似,胞外多糖(EPS)和Ⅳ型菌毛(TFP)参与的收缩模型是目前普遍接受的S运动分子机制。EPS为TFP的收缩提供了锚定的位点;细胞前导端伸出的TFP细丝抓住附近细胞产生的EPS并激发收缩,从而拉动细胞以粘-滑交替的方式前行。在这一过程中,TFP与EPS这两个胞外生物大分子之间的特异性相互作用的实质是极为重要的科学问题。在本学位论文中,我们对组成TFP的菌毛蛋白PilA与EPS在互作过程中各自参与识别的关键位点进行了探寻。首先,我们利用表面等离子共振的方法,基于直接偶联、多循环动力学-捕获、单循环动力学-捕获以及多循环动力学竞争等手段构建了 PilA-糖类生物大分子体外相互作用的检测体系。首先分析了 EPS天然类似物壳聚糖与PilA蛋白的相互作用。结果显示,不同分子量的壳聚糖均可以通过直接偶联的方式与PilA蛋白相互作用。随后,根据提取方法的不同,我们从黄色粘球菌DK1622菌株中获取了可溶性与不可溶性的EPS,在直接偶联模式下,无论是可溶性还是不可溶性的EPS均与PilA蛋白存在相互作用。直接偶联法由于偶联的方式简单被广泛应用,但是该方法也存在特异性吸附以及蛋白偶联方向不一致导致蛋白结合位点被屏蔽等弊端。因此,我们改进了检测手段,建立了多循环动力学-捕获法以及单循环动力学-捕获法,EPS与PilA蛋白相互作用的阳性信号响应值明显增大。既然EPS与PilA蛋白间存在相互作用,那么EPS参与识别PilA蛋白的关键位点是什么?我们分别检测了参与构成EPS的各个单糖组分与PilA蛋白之间的结合能力。结果显示,含有氨基的单糖能够与PilA蛋白结合,而无修饰的单糖以及N-乙酰修饰的氨基单糖均不能与PilA蛋白结合。该结果与等温滴定量热仪测定的结果一致。同时,基于多循环动力学-捕获法的竞争实验结果显示葡萄糖胺能够与EPS竞争性结合PilA蛋白。另一方面,我们对PilA蛋白参与识别EPS的关键位点也进行了分析。根据生物信息学分析的结果,我们推测PilA蛋白中有22个氨基酸残基位点可能参与了 EPS的识别。从中选取了 3个位点,即Tyr69、Trp146、Trp181,分别将其突变成为Ala。体外互作的结果显示,PilA(W146A、W181A)突变型蛋白和EPS的相互作用与野生型蛋白无差别,而PilA(Y69A)突变型蛋白与氨基糖类的相互作用消失,推测Tyr69可能是PilA蛋白与EPS互作识别时的关键位点。随后,将含有突变位点的全长PilA基因回补到PilA蛋白缺失菌株10410中,结果显示菌株 DK10410::PilAY69A,DK10410::PilAw146A和 DK10410::Pi1Aw181A在固体平板上的S运动能力丧失。在甲基纤维素实验中,菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAW146A呈现出一定程度的运动趋势,而菌株DK10410::PilAw181A没有明显运动趋势。Western Blot分析显示,三种回补菌株均没有表面菌毛,菌株菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAw146A具有全细胞菌毛蛋白。根据以上实验结果,我们认为Trp146突变后能够产生PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装,而Trp181突变后不产生任何的PilA蛋白。Tyr69突变后能够产生少量的PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q936
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本文编号：2573221